摘要：小干擾 RNA 通常通過序列特異性降解 mRNA 來阻斷基因表達。我們此前開發(fā)了一種重組腺病毒，該病毒由 U6 啟動子驅(qū)動，表達三種靶向口蹄疫病毒（FMDV）的短發(fā)夾 RNA（Ad-3siRNA）。這些短發(fā)夾 RNA 對 FMDV 表現(xiàn)出快速的抗病毒作用。在此，我們研究了 Ad-3siRNA 與口蹄疫滅活疫苗聯(lián)合使用的免疫刺激效果。在此，我們研究了 Ad-3siRNA 與口蹄疫滅活疫苗聯(lián)合使用的免疫刺激效果。通過將 Ad-3siRNA 與口蹄疫（FMD）滅活疫苗聯(lián)合使用，我們觀察到在接種后 1 周內(nèi)保護效力增強，且小鼠從接種后 1 周開始中和抗體水平升高。此外，接種疫苗和 Ad-3siRNA 聯(lián)合制劑的豬，接種后 7 周內(nèi)體液免疫顯著增強。Ad-3siRNA可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生多種細胞因子，如IFN-α、IFN-γ、IL-12、IL-6、IL-15和IL-18。總之，我們證明了 Ad-3siRNA 是一種通過人腺病毒載體遞送的新型免疫刺激 RNA，與 FMD 滅活疫苗聯(lián)合使用時可增強保護作用和體液免疫。Ad-3siRNA在其他病毒性疾病中的應(yīng)用及進一步的機制研究尚需進一步探索。

1、前言

RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)是通過小分子干擾RNA（small interfering RNAs，siRNA）或短發(fā)夾RNA（short hairpin RNAs，shRNA）引導(dǎo)的序列特異性 mRNA 降解來抑制基因表達。已有報道稱RNAi應(yīng)用存在非特異性 “脫靶效應(yīng)”。免疫刺激性 siRNA（isiRNA）除了抑制靶標(biāo)表達外，還能觸發(fā)先天免疫反應(yīng)。免疫激活通過視黃酸誘導(dǎo)基因 I（RIG-I）、黑色素瘤分化相關(guān)蛋白5（MDA-5）、蛋白激酶 R（PKR）、toll樣受體（TLR）3或TLR7/8發(fā)生。最近，有報道稱isiRNA具有抗病毒和抗腫瘤潛力。此外，isiRNA作為疫苗佐劑已被研究，可增強體液和細胞免疫。

口蹄疫（FMD）是一種急性傳染性疾病，可感染牛、豬、羊和山羊等偶蹄動物。導(dǎo)致其發(fā)熱，口腔、舌頭、乳頭和蹄部起水泡?？谔阋卟《荆?/span>FMDV）是一種單鏈正鏈 RNA 病毒，屬于小RNA病毒科Aphthovirus屬，有7個血清型和 60 多個亞型。目前使用滅活疫苗預(yù)防 FMDV 傳播，但是，應(yīng)用過程中應(yīng)根據(jù)血清型和亞型選擇不同的疫苗株。此外，使用現(xiàn)有的FMD疫苗形成抗體以控制FMD的爆發(fā)是一個漫長的過程。因此，在疫苗誘導(dǎo)的保護性免疫形成之前，可使用抗病毒藥物在爆發(fā)期間提供快速保護并減少 FMDV 的傳播。最近，我們建議將具有佐劑作用的抗病毒藥物與 FMD 滅活疫苗聯(lián)合使用，以實現(xiàn)早期保護和增強疫苗免疫。建議的抗病毒藥物是持續(xù)時間改善的豬干擾素（IFN）-α和I型IFN誘導(dǎo)劑，如槲皮素。我們觀察到I型IFN和IFN誘導(dǎo)劑在體內(nèi)能有效增強免疫力并抑制 FMDV 復(fù)制。最近，我們建議將具有佐劑作用的抗病毒藥物與 FMD 滅活疫苗聯(lián)合使用，以實現(xiàn)早期保護和增強疫苗免疫。建議的抗病毒藥物為持續(xù)時間改善的豬干擾素（IFN）-α 和 I 型 IFN 誘導(dǎo)劑，如槲皮素。我們觀察到I型IFN和IFN誘導(dǎo)劑在體內(nèi)能有效增強免疫力并抑制FMDV復(fù)制。

我們開發(fā)了一種重組腺病毒，可同時表達三種靶向 FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)域的三種短發(fā)夾RNA（shRNA），其中Ad-3siRNA能誘導(dǎo)快速（在感染后6小時內(nèi)）且有效的FMDV抑制。通過利用5型人腺病毒遞送載體，它可直接應(yīng)用于包括小鼠和豬在內(nèi)的多種宿主。我們建議通過聯(lián)合使用 siRNA和I型IFN以產(chǎn)生快速起效且持久的保護從而控制豬群中FMD。然而，我們并不排除Ad-3siRNA作為IFN誘導(dǎo)劑的潛力，因為除了一些isiRNA報道之外，還有關(guān)于Ad-3siRNA可刺激豬細胞中的干擾素刺激基因（ISG）的報告。

在此，我們研究了Ad-3siRNA與FMD滅活疫苗聯(lián)合使用的免疫刺激效果，重點關(guān)注豬細胞中I型IFN的產(chǎn)生和 ISG 的表達，以及Ad-3siRNA與FMD疫苗聯(lián)合使用在小鼠和豬中誘導(dǎo)的中和抗體滴度。

2.材料和方法

2.1.細胞和病毒

人胚胎腎（HEK）293細胞：在含4mM L-谷氨酰胺的293無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37°C、5%CO?培養(yǎng)箱中。豬腎（IBRS-2和LFBK）細胞使用添加10%胎牛血清（FBS，pH7.4）的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。表達5型人腺病毒E1 DNA的HEK293細胞用于擴增重組腺病毒和進行腺病毒滴度測定。IBRS-2 細胞用于測試干擾素和 ISG 誘導(dǎo)。LFBK細胞用于病毒中和試驗和FMDV滴度測定。表達多種靶向 FMDV 的 siRNA的重組腺病毒（Ad-3siRNA）和重組腺病毒陰性對照（Ad-null control）由我們實驗室建立。三種shRNA靶向FMDV基因組的高度保守的2B和3C區(qū)域（圖 1A）。腺病毒DNA包含三個U6啟動子、shRNA 編碼序列（2B、3C2和 3C1 shRNA）以及含六個胸苷的pol III 轉(zhuǎn)錄終止子（圖 1B）。韓國FMDV分離株O/SKR/Boeun/2017（GenBank登錄號MG983730）用于評估抗病毒效果，FMDV A/SKR/Yeoncheon/2017（GenBank登錄號KR766148）用于病毒中和抗體檢測。使用Karber法測定和計算病毒滴度（Ramakrishnan，2016）。

圖1. Ad-3siRNA示意圖。（A）口蹄疫病毒全基因組示意圖。黑色箭頭表示shRNA的靶區(qū)域。（B）Ad-3siRNA的構(gòu)建。腺病毒DNA含有三個U6啟動子、shRNA編碼序列（2B、3C 2和3C 1 shRNA）和pol III轉(zhuǎn)錄終止子。

2.2 I型干擾素蛋白檢測

將 IBRS-2細胞（3×10?個細胞/孔）接種到 24 孔板中。次日，用50感染復(fù)數(shù)（MOI）的Ad-3siRNA或Ad-null control感染細胞，在37°C下孵育。感染后2小時用新鮮培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基后，將細胞在37°C下孵育。在8、24或48小時收集上清液，使用豬 IFN-α 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒和豬 IFN-β ELISA 試劑盒測量上清液中的豬 IFN-α 和 IFN-β 水平。

2.3 干擾素測定

如前所述，通過基于 FMDV 的 IFN 測定分析 24 和 48 小時收集上清液的抗病毒活性。簡而言之，將 LFBK 細胞在 96 孔板中培養(yǎng)至90%。然后加入兩倍稀釋的上清液。24小時后，移除上清液，每孔用250 TCID₅₀的FMDV 感染 1小時，并在 37°C下孵育 48 小時。在誘導(dǎo) 50%細胞病變效應(yīng)（CPE）抑制的最高稀釋度下測量抗FMDV的抗病毒活性（單位）。

2.4 動物實驗

7 周齡雌性C57BL/6小鼠，BALB/c小鼠，FMDV中和抗體陰性（中和抗體滴度<1:8）的9周齡仔豬。

2.4.1 小鼠保護作用分析

C57BL/6小鼠（每組5只）在攻毒前1天或7天通過肌內(nèi)注射 FMD 疫苗、Ad-3siRNA 或 Ad-null control 的組合（3×10? TCID₅₀/dose）或PBS，以評估對FMDV的保護作用。FMD 滅活疫苗由A/SKR/Yeoncheon/2017的FMD疫苗抗原（0.25 μg /dose）、10%氫氧化鋁凝膠和Montanide ISA 206配制而成。通過腹腔注射250LD₅₀的小鼠適應(yīng)型 FMDV A/Malaysia/97攻擊小鼠。在攻擊后8天內(nèi)監(jiān)測小鼠的存活率。

2.4.2 小鼠體液免疫測定（短期）

為分析接種后三周的中和抗體水平，使用C57BL/6小鼠（每組5只），通過肌內(nèi)注射FMD疫苗、Ad-3siRNA或Ad-null control（3×10? TCID₅₀/dose）的組合或PBS。FMD 滅活疫苗使用A/SKR/Yeoncheon/2017 的疫苗抗原（1μg/頭份）、10% 氫氧化鋁凝膠和 Montanide ISA 206配制而成。在接種后1、2和3周采血分離血清。

2.4.3 豬體液免疫測定（長期）

為長期分析抗體水平，對豬（每組4只）通過肌內(nèi)注射FMD疫苗、疫苗和Ad-3siRNA 的組合或Ad-null control（1×101?TCID₅₀/頭份），不進行加強免疫。在 1、3、5和7周采血分離血清。

2.4.4 病毒中和試驗（VNT）

小鼠和豬血清在56℃下熱滅活30 min備用，按照《陸生動物診斷測試和疫苗手冊》（WOAH，2022）指南進行病毒中和試驗。在LFBK細胞中傳代四次的 FMDV A/SKR/Yeoncheon/2017用于VNT。

2.4.5.小鼠中細胞因子測定

如前所述進行小鼠細胞因子測定。每組4只BALB/c小鼠通過腹腔注射 0.1mL的Ad-3siRNA或Ad-null control（3×10? TCID₅₀/dose）。在接種后0、16、24和48小時采血分離血清，血清用于使用小鼠 IFN-α、IFN-γ、IL-12、IL-6、IL-15和 IL-18 ELISA試劑盒測量 IFN-α、IFN-γ、IL-12、IL-6、IL-15 和 IL-18 的濃度。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線插值確定蛋白質(zhì)濃度。

2.5.豬細胞的逆轉(zhuǎn)錄-定量PCR（RT-qPCR）分析

將 IBRS-2 細胞（1×10⁶個細胞/孔）接種到6孔板中，用50MOI的Ad-3siRNA 或 Ad-null control感染，并在 37°C 下孵育。在24和48小時收集細胞。如前所述進行 RNA 提取、DNase I處理和RT-qPCR。RT-qPCR檢測2'-5' OAS、PKR 和 Mx mRNA的ISG 表達分析以及RLR信號相關(guān)基因RIG-I、MDA-5和核因子 κB 激酶ε抑制劑（IKKε）的表達。豬甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）用作內(nèi)參。

2.6 統(tǒng)計分析

使用GraphPad Prism進行非配對t檢驗。

3 結(jié)果

3.1 Ad-3siRNA對豬細胞I型干擾素的誘導(dǎo)作用

測量用 Ad-3siRNA 或 Ad-null control 處理的豬細胞上清液中的IFN蛋白水平和抗病毒活性。與Ad-null control感染的細胞上清液相比，在Ad-3siRNA感染的細胞上清液中，24小時感染后檢測到更高水平的豬IFN-α蛋白（圖2A，P<0.01）。Ad-3siRNA 誘導(dǎo)的干擾素水平從24到48小時顯著升高（P<0.05）。48小時，在Ad-3siRNA 感染的細胞上清液中檢測到豬 IFN-β蛋白（圖2B，P<0.05）。進行IFN 測定，Ad-3siRNA 感染的細胞上清液中抗FMDV的抗病毒活性（單位/mL）從 24小時增加至 48小時（圖2C，P<0.05）。同時，在Ad-null control 感染的細胞上清液中未檢測到抑制活性。

圖2.檢測用Ad-3siRNA感染的豬細胞的上清液中的I型IFN

（A）豬IFN-α蛋白水平、（B）IFN-β蛋白的水平、(C)使用Ad 3siRNA感染的豬細胞的上清液測量抗FMDV活性

3.2.Ad-3siRNA 與 FMD 疫苗聯(lián)合在小鼠中引發(fā)早期保護和增強的中和抗體水平

為測試Ad-3siRNA與FMD疫苗在接種后1周內(nèi)的保護效果，監(jiān)測接種疫苗和Ad-3siRNA的小鼠的存活率（圖3A和B）。與PBS組小鼠相比，注射疫苗、疫苗+Ad-null control或疫苗+Ad-3siRNA的小鼠存活率更高。然而，接種后1或7天，疫苗+Ad-3siRNA組的存活率（100%）均顯著高于疫苗組或疫苗+Ad-null control 組。為評估Ad-3siRNA在接種早期對體液免疫的影響，測量了免疫后3周的中和抗體滴度（VN 滴度）（圖 3C）。疫苗+ Ad-3siRNA組在接種后1、2和3周的VN滴度均高于疫苗組或疫苗+ Ad-null control組（P<0.05）。后兩組之間的VN滴度沒有差異。此外，疫苗+ Ad-3siRNA 組的VN滴度從免疫1到2周逐漸升高（P<0.01）。

圖3. 小鼠生存曲線和中和抗體水平

（A）在FMDV感染前1天小鼠生存曲線，（B）在FMDV感染前7天小鼠生存曲線(C)血清中和抗體試驗結(jié)果。虛線表示1：32（log 10 1.5）病毒中和滴度臨界水平。

3.3 Ad-3siRNA與口蹄疫疫苗聯(lián)合應(yīng)用增強豬體液免疫情況

為評估Ad-3siRNA 對自然宿主體液免疫的持續(xù)影響，給豬單次注射疫苗或疫苗與Ad-3siRNA（或 Ad-null control）的組合，監(jiān)測免疫后7周中和抗體滴度（圖 4）。疫苗+Ad-3siRNA 組在免疫后第3、5和7周的VN滴度高于疫苗組或疫苗+ Ad-null control組（P<0.01）。除第7 周外，疫苗+ Ad-null control組的VN滴度與疫苗組無差異。此外，盡管未進行加強免疫，疫苗+ Ad-3siRNA組的VN滴度從1到7周逐漸升高（P<0.05）。同時，疫苗組的VN滴度從5到7周逐漸下降。

圖4.豬中病毒中和抗體水平

3.4.ISG和RLR的上調(diào)

測量用Ad-3siRNA或Ad-null control 處理的豬細胞中ISG（如寡腺苷酸合成酶（OAS）、粘液病毒抗性（Mx）和 PKR）的mRNA水平。與Ad-null control感染或未處理的細胞相比，Ad-3siRNA感染的細胞中觀察到顯著升高（P<0.05，圖 5A-C）。在24小時觀察到OAS和Mx的mRNA水平增強，在48小時檢測到PKR、OAS和Mx的上調(diào)。與Ad-null control感染的細胞或未處理的細胞相比，Ad-3siRNA也上調(diào)了RIG-I和MDA-5的mRNA水平（P<0.005）（圖5D和E）。另一個RLR信號相關(guān)基因IKKε在Ad-3siRNA處理后48小時上調(diào)（P<0.005）（圖 5F）。RIG-1、MDA-5和IKKe的mRNA表達從24到48小時逐漸升高（P<0.05）

圖5. Ad-3 siRNA上調(diào)豬細胞干擾素刺激基因和RIG-I樣受體信號相關(guān)基因表達

3.5 Ad-3siRNA 在小鼠中誘導(dǎo)細胞因子

為分析Ad-3siRNA在體內(nèi)誘導(dǎo)的細胞因子，測量腹腔注射Ad-3siRNA的小鼠血清樣本中的細胞因子水平。與接種Ad-null control的小鼠相比，注射Ad 3siRNA的小鼠在16-48小時內(nèi)的IFN-α、IFN-γ、IL-12、IL-6、IL-15和IL-18水平顯著升高（圖6，P < 0.05）。用Ad-null對照感染未顯著提高細胞因子水平。IFN-α、IFN-γ和IL-15蛋白水平在16小時升高，48小時達高峰（P<0.05）。IL-12水平逐漸升高，直至24小時，然后在48小時維持不變。IL-6、IL-18在16小時表達量最高，至48 h時仍維持在較高水平。

圖6. Ad-3siRNA 在小鼠中誘導(dǎo)細胞因子

4.討論

SiRNA可用于安全快速的抗病毒治療策略中。然而，外源性siRNA的作用持續(xù)時間短，并且靶病毒可進化出抗性機制以避開 siRNA。在某些情況下，siRNA誘導(dǎo)先天免疫，從而影響其療效。然而，免疫激活可能有利于控制病毒感染，isiRNA可能促進長期和廣譜的抗病毒作用。在本研究中，我們提出表達多種抗 FMDV siRNA的重組腺病毒（Ad-3siRNA）作為一種新型免疫調(diào)節(jié)劑，它可誘導(dǎo)包括I型IFN在內(nèi)的多種細胞因子，并與 FMD 疫苗聯(lián)合使用時具有佐劑作用。

Ad-3siRNA旨在抑制多種血清型的 FMDV。Ad-3siRNA 是一種直接作用的 FMDV抑制劑，這也是其作用迅速的原因。靶區(qū)域是2B和3C基因，已知它們是FMDV基因組中最保守的區(qū)域。我們先前觀察到僅注射Ad-3siRNA的乳鼠對FMDV有保護作用（7天存活率約90%）。這種抑制可能是由于多種siRNA的基因沉默，而非免疫調(diào)節(jié)導(dǎo)致，因為乳鼠沒有包括先天免疫在內(nèi)的成熟的免疫系統(tǒng)。此外，由于半衰期短，進行了三次Ad-3siRNA注射。有鑒于此，我們采用Ad-3siRNA與I型IFN（豬IFN-α）聯(lián)合使用，以克服siRNA的缺點，如作用時間短和因病毒突變而降低效力。I型IFN（或IFN誘導(dǎo)劑）通過增強抗病毒作用和體液免疫，可能是一種有前景的快速有效保護策略。在本研究中，我們清楚地表明Ad-3siRNA在體外和體內(nèi)誘導(dǎo)I型IFN，因此可有效用作FMD疫苗佐劑。

Ad-3siRNA與FMD疫苗聯(lián)合使用時，除了增強體內(nèi)中和抗體的產(chǎn)生外，還刺激了多種細胞因子的產(chǎn)生，如I型IFN、IFN-γ、IL-12、IL-15、IL-6和IL-18。據(jù)報道，IFN-α為FMD疫苗的有效佐劑。此外，IFN-γ、IL-12 和 IL-15 參與 T 細胞免疫并對病毒復(fù)制產(chǎn)生抑制作用。IL-18刺激B細胞增殖、IFN-γ產(chǎn)生和輔助性T細胞2（Th2）反應(yīng)。IL-6也是B細胞活化的關(guān)鍵細胞因子。盡管Ad-3siRNA誘導(dǎo)細胞因子，但我們在實驗小鼠和豬中未觀察到副作用。在我們的小鼠實驗中未觀察到體重減輕、異常運動或死亡。在豬實驗中，我們同時使用Ad-3siRNA和FMD疫苗，也未觀察到死亡、異常運動或皮疹。注射I型IFN或IFN誘導(dǎo)劑的動物通常會出現(xiàn)暫時性體溫升高。然而，這種癥狀通常在1到2天內(nèi)消失，并且在Ad-3siRNA組中不明顯。Ad-3siRNA 的佐劑有效性和安全性是劑量依賴性的，應(yīng)在豬中進行實際應(yīng)用測試。

除佐劑作用外，Ad-3siRNA誘導(dǎo)I型IFN在控制病毒方面可能具有優(yōu)勢。（1）我們認為Ad-3siRNA 的抗病毒作用可能通過其免疫調(diào)節(jié)作用介導(dǎo)。I型IFN是對抗FMDV產(chǎn)生的最有效的抗病毒蛋白之一。此外，我們觀察到小鼠對FMDV的保護作用（100% 存活率）在注射后7天得以維持。I型IFN廣泛抑制病毒復(fù)制并刺激免疫細胞，包括樹突狀細胞、B細胞和T細胞。（2）盡管Ad-3siRNA最初被開發(fā)為一種僅靶向FMDV的siRNA，但我們觀察到它具有廣泛的抗病毒效果，不僅限于FMDV，還針對BEV和PRRSV。眾所周知，I型IFN對多種病毒具有抗病毒作用。在不同種屬（如豬、牛和猴）的細胞中觀察到這些效應(yīng)。除了誘導(dǎo)小鼠IFN-α和IFN-β外，還在豬細胞中也誘導(dǎo)豬IFN-α和IFN-β。此外，本研究中使用的人腺病毒載體具有廣泛的宿主范圍，包括豬和牛。已有幾項使用5型人腺病毒載體控制FMDV的研究報道。因此，我們認為Ad-3siRNA可用于不同動物體內(nèi)抗多種病毒的研究。

人腺病毒5型在 HEK293細胞中產(chǎn)生?？僧a(chǎn)生高滴度的重組腺病毒（~1011?12 pfu/mL），并且在 HEK293細胞中可進行懸浮培養(yǎng)。我們認為，由于Ad-3siRNA 在293細胞中不產(chǎn)生蛋白質(zhì)，因此在家畜中的應(yīng)用不需要特殊的純化過程。我們使用CRISPR Cas-9技術(shù)開發(fā)了IFNAR KO 293懸浮細胞系，并且在這些細胞系中獲得更高滴度的重組腺病毒。因此，我們認為，對于5型腺病毒載體的應(yīng)用，成本不會是一個重大問題。實際生產(chǎn)成本取決于公司的生產(chǎn)效率。此外，應(yīng)考慮家畜的效果和成本來確定最佳劑量。

Ad-3siRNA的免疫刺激作用機制尚不清楚。一種可能性是Ad-3siRNA可通過 RIG-I和（或）MDA-5信號傳導(dǎo)誘導(dǎo)先天免疫。RLRs是檢測病原體相關(guān)分子模式并啟動包括I型IFN表達在內(nèi)的抗病毒反應(yīng)的細胞質(zhì) dsRNA傳感器。RLRs包括MDA-5、RIG-I和遺傳學(xué)與生理學(xué)實驗室 2（LGP2）。其中，MDA-5和RIG-I與病毒RNA的結(jié)合觸發(fā)信號級聯(lián)以誘導(dǎo)I型IFN表達。我們觀察到，盡管在RIG-I敲除細胞和對照細胞中OAS的mRNA水平上調(diào)，但在MDA-5敲除細胞中未增強（圖S1）。還表明Ad-3siRNA可能是RIG-I和MDA-5的雙重激動劑，可上調(diào)RIG-I、MDA-5和IKKε的表達。在基因設(shè)計方面，我們認為使用多個shRNA和U6（Pol III）啟動子表達shRNA可能是Ad-3siRNA誘導(dǎo)I型IFN的關(guān)鍵因素。先前的研究也報道，與 Pol II 啟動子相比，具有 U6（RNA 聚合酶III）啟動子表達 shRNA 的病毒載體更可能誘導(dǎo) IFN。此外，觀察到與三種shRNA不同，用表達由U6啟動子驅(qū)動的單個shRNA的腺病毒處理的細胞中，ISG mRNA沒有上調(diào)。因此，有必要詳細研究Ad-3siRNA引發(fā)的IFN信號傳導(dǎo)機制。

總之，我們的研究表明，通過人腺病毒載體遞送的新型免疫刺激RNA Ad-3siRNA是一種有前景的佐劑，它可誘導(dǎo)多種細胞因子并通過刺激中和抗體產(chǎn)生來增強FMD疫苗的效果。因此，Ad-3siRNA與疫苗聯(lián)合使用可能更有效地預(yù)防FMD的傳播。未來，應(yīng)探索Ad-3siRNA在不同動物的多種病毒性疾病中的應(yīng)用，并進行詳細的機制研究。