摘要

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）屬于冠狀病毒科（Coronaviridae）甲型冠狀病毒屬（Alphacoronavirus），在血清陰性新生仔豬中引起急性腹瀉/嘔吐、脫水和高死亡率。在過(guò)去的三十年里，PEDV感染給歐洲和亞洲的養(yǎng)豬業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失，但在2013-2014年，該病也在美國(guó)、加拿大和墨西哥被報(bào)道。從2013年4月至今，美國(guó)的PED疫情已導(dǎo)致美國(guó)生豬存欄量損失超過(guò)10%。

流行性PED的消失和再次出現(xiàn)表明該病毒能夠逃脫當(dāng)前的疫苗接種方案、生物安全和控制系統(tǒng)。地方性PED是一個(gè)重大問(wèn)題，多種PEDV變異株的出現(xiàn)（或潛在輸入）加劇了這一問(wèn)題。流行性PEDV毒株傳播迅速，導(dǎo)致大量豬只死亡。這些毒株具有高度腸道致病性，會(huì)急性感染整個(gè)小腸和大腸的絨毛上皮細(xì)胞，但空腸和回腸是主要感染部位。PEDV感染引起急性、嚴(yán)重的萎縮性腸炎，伴有病毒血癥，導(dǎo)致嚴(yán)重腹瀉和嘔吐，繼而發(fā)生嚴(yán)重脫水，這是哺乳仔豬死亡的主要原因。需要全面了解流行性或地方性PEDV毒株的致病特征，以在受影響地區(qū)預(yù)防和控制該病，并開(kāi)發(fā)有效的疫苗。本綜述重點(diǎn)關(guān)注PEDV感染的病原學(xué)、流行病學(xué)、疾病機(jī)制、發(fā)病機(jī)制以及免疫預(yù)防。

引言

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）屬于套式病毒目（Nidovirales）冠狀病毒科（Coronaviridae）甲型冠狀病毒屬（Alphacoronavirus），在新生仔豬中引起急性腹瀉、嘔吐、脫水和高度死亡，導(dǎo)致重大經(jīng)濟(jì)損失。該病最初在過(guò)去30年里在歐洲和亞洲的養(yǎng)豬業(yè)中被報(bào)道，該病毒最早于20世紀(jì)70年代初出現(xiàn)在英格蘭和比利時(shí)。最近，PEDV也在美國(guó)被報(bào)道。此后，該病毒在美國(guó)全國(guó)范圍內(nèi)迅速傳播，并傳播到北美其他國(guó)家，包括加拿大和墨西哥。由于PEDV的顯著影響，在僅一年的流行期后，美國(guó)養(yǎng)豬業(yè)損失了其國(guó)內(nèi)生豬存欄量的近10%，相當(dāng)于約700萬(wàn)頭仔豬。

PEDV與另一種甲型冠狀病毒，傳染性胃腸炎病毒（TGEV）之間相似的流行病學(xué)和臨床特征導(dǎo)致診斷復(fù)雜化，需要進(jìn)行鑒別性實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。自1984年TGEV的一種天然刺突蛋白基因缺失突變體——豬呼吸道冠狀病毒（PRCV）出現(xiàn)以來(lái)，由于與TGEV存在交叉保護(hù)性免疫，TGEV在PRCV血清陽(yáng)性的豬群中傳播減少。相比之下，PEDV繼續(xù)在全球傳播并造成經(jīng)濟(jì)問(wèn)題。

基于遺傳分析，冠狀病毒科可分為四個(gè)屬：甲型冠狀病毒屬（Alphacoronavirus）、乙型冠狀病毒屬（Betacoronavirus）、丙型冠狀病毒屬（Gammacoronavirus）和丁型冠狀病毒屬（Deltacoronavirus）。認(rèn)為蝙蝠是甲型和乙型冠狀病毒的基因來(lái)源宿主，而鳥(niǎo)類(lèi)被認(rèn)為是丙型和丁型冠狀病毒的疑似宿主。在PEDV流行的美國(guó)不同地區(qū)，一種在遺傳上與PEDV不同的新型冠狀病毒——豬丁型冠狀病毒（PDCoV），經(jīng)常同時(shí)出現(xiàn)在豬的腹瀉糞便樣本中。據(jù)報(bào)道，PDCoV在田間臨床影響和疾病嚴(yán)重程度低于PEDV。最近的一項(xiàng)研究證實(shí)，PDCoV對(duì)豬具有腸道致病性，會(huì)急性感染小腸，引起嚴(yán)重腹瀉和/或嘔吐以及萎縮性腸炎，其臨床癥狀與PEDV和TGEV感染相似。目前，對(duì)PEDV、PDCoV和TGEV的鑒別診斷對(duì)于控制美國(guó)養(yǎng)豬場(chǎng)病毒性流行性腹瀉至關(guān)重要。

本綜述重點(diǎn)關(guān)注當(dāng)前對(duì)PEDV的病因?qū)W、流行病學(xué)、疾病機(jī)制、發(fā)病機(jī)制的理解以及可用于預(yù)防PEDV感染的控制措施。

病原學(xué)

PEDV的結(jié)構(gòu)與基因組

PEDV具有包膜，呈多形性，直徑范圍（包括突起）為95-190 nm，突起長(zhǎng)度約為18 nm。PEDV結(jié)構(gòu)和基因組的詳細(xì)信息可參見(jiàn)其他文獻(xiàn)。PEDV具有一個(gè)大小約為28 kb的單股正鏈RNA基因組（不包括poly A尾），編碼四種結(jié)構(gòu)蛋白：刺突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣殼蛋白（N），以及四種非結(jié)構(gòu)蛋白：1a、1b、3a和3b。在病毒蛋白中，S蛋白對(duì)于調(diào)節(jié)與特定宿主細(xì)胞受體糖蛋白的相互作用以介導(dǎo)病毒進(jìn)入以及誘導(dǎo)中和抗體至關(guān)重要。S蛋白還與PEDV在體外的生長(zhǎng)適應(yīng)性及體內(nèi)毒力的減弱有關(guān)。M蛋白是包膜中最豐富的病毒蛋白成分，通過(guò)與S蛋白和N蛋白相互作用，在病毒組裝中發(fā)揮重要作用。冠狀病毒的N蛋白結(jié)合RNA并將病毒基因組RNA包裝到病毒顆粒的核衣殼中。

PEDV的生物學(xué)和理化特性

先前一項(xiàng)使用細(xì)胞適應(yīng)性德國(guó)分離株V215/78的研究記錄了PEDV的生物學(xué)和理化特性。PEDV的浮力密度為1.18。PEDV易被乙醚或氯仿滅活，與較高溫度相比，在4–50 °C下相對(duì)穩(wěn)定。在細(xì)胞培養(yǎng)基中于4°C、pH范圍（3-10）下孵育6小時(shí)后，PEDV表現(xiàn)出低到中等的殘留感染性；而在37°C下孵育6小時(shí)，僅在pH范圍5-8.5之間保留其感染性，在pH < 4 和 > pH 9時(shí)病毒完全失活。這些數(shù)據(jù)表明，如果在較高溫度（>37°C）下應(yīng)用酸性或堿性消毒劑一定時(shí)間，PEDV將被滅活。

PEDV毒株V215/78不能被TGEV抗血清中和。這一發(fā)現(xiàn)得到了另一份報(bào)告的支持，該報(bào)告通過(guò)免疫電鏡和免疫熒光（IF）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PEDV CV777毒株與比利時(shí)TGEV毒株或貓傳染性腹膜炎病毒（FIPV）均無(wú)交叉反應(yīng)性。然而，隨后的研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)更靈敏的檢測(cè)方法，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫印跡和免疫沉淀，PEDV和FIPV之間存在可檢測(cè)的雙向交叉反應(yīng)性。這些差異表明，PEDV與其他冠狀病毒之間的交叉反應(yīng)性可能因技術(shù)靈敏度和測(cè)試的病毒株而異。最近的一項(xiàng)研究報(bào)告了原型CV777和近期美國(guó)PEDV毒株與TGEV（Miller毒株）之間存在抗原交叉活性的證據(jù)，因?yàn)樗鼈冊(cè)谄?/span>N蛋白的N末端區(qū)域至少共享一個(gè)保守表位。

PEDV的滅活

Pospischil等人（2002）證明PEDV可被消毒劑滅活，即氧化劑（Virkon S）、漂白劑、酚類(lèi)化合物（One-Stroke Environ; Tek-Trol）、2%氫氧化鈉、甲醛和戊二醛、碳酸鈉（4%無(wú)水或10%結(jié)晶，含0.1%洗滌劑）、離子和非離子洗滌劑、1%強(qiáng)效碘伏（溶于磷酸中）以及脂溶劑如氯仿。

用于病毒分離的細(xì)胞培養(yǎng)

Vero（非洲綠猴腎）細(xì)胞支持在補(bǔ)充有外源性蛋白酶胰蛋白酶的細(xì)胞培養(yǎng)物中分離和連續(xù)傳代培養(yǎng)PEDV。另一種非洲綠猴腎細(xì)胞系MARC-145也支持PEDV的后續(xù)細(xì)胞傳代。胰蛋白酶在PEDV病毒粒子進(jìn)入Vero細(xì)胞和釋放中發(fā)揮重要作用，有助于病毒在體外有效復(fù)制并傳播到鄰近細(xì)胞。胰蛋白酶導(dǎo)致S蛋白裂解為S1和S2亞基，這很可能是細(xì)胞間融合以及病毒粒子從感染的Vero細(xì)胞中釋放的原因。細(xì)胞病變效應(yīng)包括空泡化和合胞體形成，這是細(xì)胞凋亡性死亡的結(jié)果。PEDV的血凝活性僅在胰蛋白酶處理后才能在兔紅細(xì)胞上得到證實(shí)。不同國(guó)家報(bào)道的PEDV只有一個(gè)血清型。

流行病學(xué)

PEDV全球流行病學(xué)

PEDV最早于20世紀(jì)70年代初出現(xiàn)在英國(guó)（Wood, 1977）和比利時(shí)。該病毒于1977年在比利時(shí)首次分離，并被歸類(lèi)于冠狀病毒科。隨后，在20世紀(jì)80年代和90年代，PEDV在日本和韓國(guó)被確認(rèn)為是造成嚴(yán)重流行的原因。盡管廣泛應(yīng)用了PEDV疫苗，PED在韓國(guó)仍然呈地方性流行。

在20世紀(jì)80年代和90年代的歐洲，PED暴發(fā)并不頻繁，但該病毒繼續(xù)傳播并以地方性形式在豬群中持續(xù)存在。隨后的血清學(xué)調(diào)查顯示歐洲豬群中PEDV的流行率為低到中度。然后，歐洲豬群中PEDV的流行率大幅下降，盡管原因尚不清楚。PED的暴發(fā)在歐洲僅零星觀察到：1989-1991年在荷蘭；1995年在匈牙利，以及1998年在英格蘭。然而，2005-2006年在意大利發(fā)現(xiàn)了一次典型的流行性PED暴發(fā)。

2007-2008年在泰國(guó)，報(bào)道了幾次嚴(yán)重的PED暴發(fā)，其泰國(guó)PEDV分離株在系統(tǒng)發(fā)育上與中國(guó)的JS-2004-2毒株屬于同一分支。這種新基因型的PEDV繼續(xù)在泰國(guó)引起零星暴發(fā)。

2010-2012年在中國(guó)，不同地區(qū)報(bào)道了血清陽(yáng)性豬群中嚴(yán)重的PED暴發(fā)。自PEDV首次在中國(guó)出現(xiàn)近二十年來(lái)，許多豬群都接種了原型毒株CV777滅活疫苗或相關(guān)疫苗。然而，接種疫苗豬群中哺乳仔豬的中到高度死亡率表明CV777疫苗有效性較低。2010-2012年中國(guó)的PED暴發(fā)是由經(jīng)典的和新的PEDV變異株共同引起的，這些變異株在遺傳上不同于原型CV777。

2013-2014年美國(guó)PEDV分子流行病學(xué)

2013年首次暴發(fā)期間鑒定的美國(guó)PEDV毒株在遺傳上與2011-2012年報(bào)道的中國(guó)毒株（China/2012/AH2012）密切相關(guān)，表明類(lèi)似AH2012的中國(guó)PEDV毒株在美國(guó)出現(xiàn)。類(lèi)似美國(guó)的PEDV毒株也在2013年末和2014年初在韓國(guó)和臺(tái)灣的腹瀉仔豬中發(fā)現(xiàn)，但中國(guó)或美國(guó)的PEDV毒株是否可能傳播到韓國(guó)和臺(tái)灣的豬尚不清楚。需要進(jìn)一步調(diào)查以澄清在相關(guān)暴發(fā)首次被發(fā)現(xiàn)之前，中國(guó)或美國(guó)的PEDV毒株是否已經(jīng)存在于韓國(guó)和臺(tái)灣。

首次暴發(fā)后不到一年，發(fā)現(xiàn)了其他新型美國(guó)PEDV毒株（OH/OH851），其S基因存在多處缺失和插入，與中國(guó)的HBQX-2010或CH/ZMZDY/11毒株關(guān)系密切，而非AH2012。與主要的美國(guó)PEDV毒株相比，這些毒株在5'端S1區(qū)域（前1170個(gè)核苷酸）具有較低的核苷酸同源性，而在剩余的S基因中具有較高的核苷酸同源性。涉及中國(guó)毒株的可能的重組事件可能促進(jìn)了美國(guó)PEDV的快速進(jìn)化和多種變異株的出現(xiàn)，使美國(guó)PEDV毒株的分子流行病學(xué)復(fù)雜化。

值得注意的是，首次暴發(fā)僅一年后，出現(xiàn)了另一種PEDV變異株，該變異株在主要細(xì)胞培養(yǎng)的美國(guó)PEDV毒株（如PEDV毒株TC-PC22A，GenBank登錄號(hào)KM392224）的S蛋白N端部分存在一個(gè)大的197個(gè)氨基酸（aa）缺失。在韓國(guó)PEDV毒株中也鑒定出另一種在S蛋白713-916位點(diǎn)存在大片段（204 aa）缺失的PEDV變異株。

傳播

糞-口途徑是PEDV傳播的主要方式，盡管氣溶膠化的PEDV仍具有感染性。腹瀉糞便和/或嘔吐物以及其他受污染的污染物，如運(yùn)輸拖車(chē)和飼料，可能是該病毒的主要傳播源。PEDV的另一個(gè)可能的儲(chǔ)存庫(kù)包括攜帶者，例如無(wú)癥狀感染的年長(zhǎng)豬，病毒在其中以亞臨床方式傳播。

先前的研究顯示，在受感染的哺乳母豬的乳汁樣本中，PEDV RNA的檢出率較低到中等（23-41%），表明母豬乳汁可能是PEDV垂直傳播的潛在途徑。我們的研究表明，在實(shí)驗(yàn)感染仔豬或自然感染生長(zhǎng)豬的急性期血清樣本中，PEDV RNA的檢出率顯著（55-100%）。用作飼料添加劑的豬血漿是否可能是PEDV的傳播源仍有疑問(wèn)，因?yàn)閮身?xiàng)不同的感染研究報(bào)道了不一致的結(jié)果，這些研究調(diào)查了檢測(cè)出PEDV RNA陽(yáng)性的噴霧干燥豬血漿是否對(duì)血清陰性豬具有傳染性。

PEDV的疾病機(jī)制與發(fā)病機(jī)制

PEDV的組織嗜性

豬小腸絨毛腸細(xì)胞大量表達(dá)氨肽酶N（APN），這是一種150-kDa的糖基化跨膜蛋白，被鑒定為PEDV的細(xì)胞受體。腸細(xì)胞上高密度的受體使PEDV能夠通過(guò)病毒-受體相互作用進(jìn)入并復(fù)制。PEDV具有細(xì)胞溶解性，受感染的腸細(xì)胞迅速發(fā)生急性壞死，導(dǎo)致小腸（而非大腸）出現(xiàn)顯著的絨毛萎縮（圖1A）。PEDV抗原主要在小腸（十二指腸至回腸）（圖1B）和大腸（直腸除外）的絨毛腸細(xì)胞中觀察到。

與TGEV類(lèi)似，PEDV可能不會(huì)誘導(dǎo)感染豬小腸腸細(xì)胞的凋亡性死亡（圖1C, D）。在感染后期，偶爾在腸隱窩細(xì)胞或派伊爾氏結(jié)中檢測(cè)到少量PEDV陽(yáng)性細(xì)胞。在我們的初步研究中，無(wú)菌豬在接種后小時(shí)（PHI）30-72時(shí)，每個(gè)腸絨毛的平均杯狀細(xì)胞數(shù)量（<2個(gè)/絨毛）少于陰性對(duì)照豬（6-18個(gè)/絨毛）（圖2）。

與TGEV類(lèi)似，PEDV可能感染杯狀細(xì)胞，導(dǎo)致腹瀉早期該細(xì)胞類(lèi)型數(shù)量急劇減少。杯狀細(xì)胞分泌粘蛋白，提供腸道抵抗微生物的第一道防線。經(jīng)口鼻感染的豬的肺組織PEDV抗原呈陰性，表明下呼吸道沒(méi)有PEDV復(fù)制的證據(jù)。在其他主要器官，如幽門(mén)、扁桃體、脾臟、肝臟和腎臟中未檢測(cè)到PEDV抗原。然而，最近的一項(xiàng)研究報(bào)道了PEDV在豬肺巨噬細(xì)胞中的體外和體內(nèi)復(fù)制。仍不確定PEDV是否發(fā)生腸外復(fù)制。

疾病進(jìn)展過(guò)程中PEDV在腸道的復(fù)制

PEDV結(jié)合并感染表達(dá)APN的腸細(xì)胞。病毒在受感染的腸細(xì)胞中通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等胞質(zhì)內(nèi)膜出芽迅速組裝。在潛伏期，整個(gè)小腸可見(jiàn)PEDV抗原陽(yáng)性細(xì)胞，多達(dá)30-50%的吸收上皮細(xì)胞呈陽(yáng)性，這與感染急性期無(wú)癥狀豬的糞便排毒一致。從感染的急性期到中期（臨床癥狀出現(xiàn)后24-60小時(shí)），整個(gè)小腸和大腸可見(jiàn)中等到大量的PEDV抗原陽(yáng)性細(xì)胞，常累及整個(gè)絨毛上皮。在感染后期（臨床癥狀出現(xiàn)后>72小時(shí)），仍觀察到大量PEDV感染的上皮細(xì)胞，提示PEDV對(duì)再生的腸細(xì)胞存在再感染。

病理生理學(xué)

PEDV引起的腹瀉是由于大量吸收性腸細(xì)胞損失導(dǎo)致的吸收不良的結(jié)果。受感染腸細(xì)胞的功能障礙也促成了吸收不良性腹瀉。在電鏡下檢查受感染的腸細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)電子密度降低和線粒體快速變性導(dǎo)致吸收所需的轉(zhuǎn)運(yùn)能量缺乏。在受感染的結(jié)腸上皮細(xì)胞中觀察到的超微結(jié)構(gòu)變化和輕度空泡化可能干擾水和電解質(zhì)的重要重吸收。嘔吐加劇了脫水，但PEDV感染誘發(fā)嘔吐的機(jī)制尚不清楚。

類(lèi)似于急性TGEV感染中的高鉀血癥和酸中毒，我們的初步研究表明，在出現(xiàn)嚴(yán)重水樣腹瀉后1天，接種PEDV的仔豬表現(xiàn)出高鈉血癥、高鉀血癥和高氯血癥，但鈣和碳酸氫鹽水平低。腹瀉仔豬小腸中刷狀緣膜結(jié)合的消化酶，如雙糖酶（乳糖酶、蔗糖酶、和麥芽糖酶）、亮氨酸APN和堿性磷酸酶顯著降低。小腸中酶活性的降低導(dǎo)致消化不良性腹瀉。在我們的初步研究中，在PHI 30-120時(shí)，受感染無(wú)菌豬的小腸中觀察到緊密連接蛋白（ZO-1）和粘附連接蛋白（E-鈣粘蛋白）的分布紊亂、不規(guī)則以及表達(dá)減少（圖3）。受損的腸道完整性可能導(dǎo)致水分因PEDV感染引起的高滲透壓而流失到腸腔，并攝取腸腔細(xì)菌引起混合感染。

Fig. 1.接種美國(guó)PEDV株PC 21 A的無(wú)菌豬的腸道中的組織病理學(xué)、通過(guò)免疫熒光染色定位豬流行性腹瀉病毒（PEDV）抗原，以及通過(guò)原位端粒檢測(cè)的細(xì)胞死亡。(A)接種后46小時(shí)（出現(xiàn)臨床體征時(shí)），接種豬的經(jīng)莫林和伊紅（H & E）染色的腸，顯示急性彌漫性、嚴(yán)重萎縮性甲狀腺炎，絨毛高度與陰囊深度之比（VH：CD）& T &原始放大倍數(shù)x 200。(B)PIH 30（出現(xiàn)臨床癥狀后4-5小時(shí)）接種豬的腸免疫熒光（IF）染色，顯示萎縮絨毛內(nèi)襯的表皮細(xì)胞PEDV抗原呈陽(yáng)性。原始放大倍數(shù)x 200。(C)與D組（陰性對(duì)照）相比，對(duì)接種豬福爾馬林固定的、蠟包埋的腸進(jìn)行原位TLR染色（B組），顯示通過(guò)IF染色對(duì)PEDV抗原呈陽(yáng)性的內(nèi)皮萎縮絨毛中的TLR陽(yáng)性（細(xì)胞死亡）細(xì)胞（紅色染色）沒(méi)有增加。原始放大倍數(shù)x 200。(D)對(duì)未接種的陰性對(duì)照豬的福爾馬林固定、蠟包埋的腸腸絨毛皮中進(jìn)行原位TLR染色，顯示腸絨毛皮中很少有TLR陽(yáng)性（細(xì)胞死亡）細(xì)胞（紅色染色）。注意固有層中有一些TLR陽(yáng)性細(xì)胞（紅色染色）。原始放大倍數(shù)x 200。IL，腸腔。在B組中，細(xì)胞核用藍(lán)色熒光4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽染色。TLR，原位末端去氧核苷轉(zhuǎn)移酶修飾的dGPT缺口末端標(biāo)記。

PED的抵抗力與日齡關(guān)系

PEDV感染在哺乳仔豬中比在斷奶豬中誘導(dǎo)更嚴(yán)重的疾病和死亡的機(jī)制尚未明確闡明。幾個(gè)可能影響哺乳仔豬對(duì)PEDV感染易感性更高和疾病恢復(fù)時(shí)間更長(zhǎng)的解剖學(xué)和生理學(xué)因素包括：新生仔豬腸細(xì)胞更新較慢（5-7天），而3周齡斷奶豬為2-3天。

腸道上皮的高更新率依賴于在腸隱窩中發(fā)現(xiàn)的干細(xì)胞。腸道干細(xì)胞主要包括三種細(xì)胞類(lèi)型：LGR5（富含亮氨酸重復(fù)序列的G蛋白偶聯(lián)受體5）陽(yáng)性隱窩基底柱狀細(xì)胞（LGR5+細(xì)胞）、+4細(xì)胞和潘氏細(xì)胞（Paneth cells）。然而，豬腸道中是否存在潘氏細(xì)胞存在爭(zhēng)議。

我們的初步研究揭示了在PEDV感染豬的隱窩細(xì)胞層中存在大量LGR5+細(xì)胞（圖4），表明存在對(duì)PEDV感染急性期上皮細(xì)胞更新至關(guān)重要的干細(xì)胞。該研究還揭示了在未感染PEDV的哺乳仔豬（9日齡）小腸中缺乏LGR5+細(xì)胞且隱窩細(xì)胞增殖低下（隱窩細(xì)胞中Ki67蛋白表達(dá)少），可能導(dǎo)致腸細(xì)胞更新緩慢。然而，在PEDV感染后3-5天，LGR5+細(xì)胞的數(shù)量和隱窩細(xì)胞的增殖顯著增加，導(dǎo)致替換從受感染絨毛脫落的壞死腸細(xì)胞。另一方面，未感染PEDV的斷奶豬（3周齡）表現(xiàn)出高隱窩細(xì)胞增殖能力和隱窩中存在大量LGR5+細(xì)胞，這與腸細(xì)胞的快速更新率有關(guān)。大量的LGR5+細(xì)胞和隱窩細(xì)胞的高繁殖得以維持，可能導(dǎo)致斷奶豬從PED中迅速恢復(fù)。

圖2。通過(guò)甲氧胺藍(lán)染色確定，接種美國(guó)豬流行性腹瀉病毒（PEDV）株PC 21 A的無(wú)菌豬的小腸杯狀細(xì)胞數(shù)量減少。(A)接種后72小時(shí)（出現(xiàn)臨床癥狀后26-28小時(shí)）接種豬的甲狀腺，每個(gè)絨毛顯示很少有杯狀細(xì)胞。原始放大倍數(shù)，x 200。(B)陰性對(duì)照豬的甲狀腺，每個(gè)絨毛顯示少量至中等數(shù)量的杯狀細(xì)胞（箭頭）。原始放大倍數(shù)，x 200。(C)PIH 72（出現(xiàn)臨床癥狀后26-28小時(shí)）接種豬的免疫結(jié)果，每個(gè)絨毛顯示很少有杯狀細(xì)胞。原始放大倍數(shù)，x 80。(D)陰性對(duì)照豬的圖像，顯示每個(gè)絨毛中有中等至大量的杯狀細(xì)胞（箭頭）。原始放大倍數(shù)，x 80。

病毒血癥

在接種美國(guó)PEDV毒株（PC21A）的無(wú)菌仔豬感染急性期至后期階段檢測(cè)到病毒血癥，血清中病毒RNA范圍在4.8至7.6 log₁₀基因組當(dāng)量（GE）/mL之間。在田間樣本中也觀察到類(lèi)似結(jié)果，顯示從13-20周齡腹瀉豬收集的20份急性期血清樣本中有11份（55%）含有病毒RNA滴度（4.0–6.3 log₁₀ GE/mL）。早期嚴(yán)重的腹瀉/嘔吐和高PEDV糞便排毒滴度可能伴隨病毒血癥，但尚未有人證實(shí)在血清中存在感染性病毒。

對(duì)PEDV的免疫反應(yīng)

關(guān)于對(duì)PEDV的先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的信息匱乏。PEDV感染后，在小腸固有層中觀察到淋巴細(xì)胞（在PHI 30-120時(shí)為CD4+和CD8+ T細(xì)胞）（圖5）、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)。在接種CV777毒株的常規(guī)豬中研究了全身和粘膜相關(guān)淋巴組織中的同種型特異性抗體分泌細(xì)胞以及血清抗體反應(yīng)。表達(dá)PEDV E蛋白的培養(yǎng)腸上皮細(xì)胞在體外上調(diào)白細(xì)胞介素（IL）-8的表達(dá)。

PEDV的減毒

流行性PEDV毒株的致病性通常很?chē)?yán)重，表現(xiàn)為受感染哺乳仔豬的高死亡率。然而，通過(guò)高代次細(xì)胞培養(yǎng)傳代（93-100代）引起PEDV毒株的毒力減弱。與其親本野生型毒株相比，減毒的PEDV毒株在其S基因和開(kāi)放閱讀框3（ORF3）基因中存在多處核苷酸變化。在ORF3的652個(gè)核苷酸中，在親本野生型DR13 PEDV和經(jīng)細(xì)胞傳代適應(yīng)（100代）并被證實(shí)減毒的PEDV之間鑒定出兩個(gè)缺失和七個(gè)變化。值得注意的是，兩種減毒PEDV毒株——韓國(guó)DR13（100代）和日本83P-5（100代）的S基因與其親本病毒相比，具有顯著相似性，存在可比的核苷酸突變和氨基酸（aa）替換。減毒的83P-5在S基因中有18個(gè)核苷酸突變和13個(gè)預(yù)測(cè)的aa替換。

同樣，對(duì)美國(guó)PEDV毒株和體外傳代病毒（在MARC-145細(xì)胞中傳10代）的序列分析表明，細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)過(guò)程特異性地修飾了PEDV S蛋白（6個(gè)aa替換）而開(kāi)放閱讀框1a/b（ORF1a/b）編碼的多聚蛋白、ORF3、E、M和N蛋白保持不變。PEDV S基因中的多處核苷酸突變和aa替換可能有助于其體內(nèi)致病性的減弱，但需要對(duì)整個(gè)PEDV基因組進(jìn)行測(cè)序以驗(yàn)證減毒后的其他變化。

Fig.3. 通過(guò)免疫熒光染色顯示美國(guó)豬流行性腹瀉病毒（PEDV）PC21A接種的無(wú)菌豬小腸中緊密連接蛋白（ZO-1）（A, B）和粘附連接蛋白（E-鈣粘蛋白）（C, D）的表達(dá)。(A) 陰性對(duì)照豬的空腸，顯示絨毛上皮細(xì)胞頂表面ZO-1（綠色染色）分布良好、表達(dá)廣泛。原始放大倍數(shù)，×400。(B) 接種豬在接種后小時(shí)（PHI）30（臨床癥狀出現(xiàn)后4-5小時(shí)）的空腸，顯示與陰性對(duì)照（圖A）相比，絨毛上皮細(xì)胞頂表面ZO-1（綠色染色）分布紊亂、不規(guī)則，表達(dá)中度減少。原始放大倍數(shù)，×400。(C) 陰性對(duì)照豬的空腸，顯示絨毛上皮細(xì)胞頂表面和基底外側(cè)表面以及細(xì)胞質(zhì)中輕度表達(dá)的E-鈣粘蛋白（綠色染色）分布良好、表達(dá)廣泛。原始放大倍數(shù)，×600。(D) 接種豬在PHI 30（臨床癥狀出現(xiàn)后4-5小時(shí)）的空腸，顯示與陰性對(duì)照（圖C）相比，絨毛上皮細(xì)胞頂表面和基底外側(cè)表面的E-鈣粘蛋白（綠色染色）分布紊亂、不規(guī)則，表達(dá)中度減少。原始放大倍數(shù)，×600。細(xì)胞核用藍(lán)色熒光染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽（DAPI）染色。使用針對(duì)人重組ZO-1和E-鈣粘蛋白（Invitrogen）的單克隆抗體進(jìn)行免疫熒光染色。

流行性PED（PEDV感染的流行形式）與地方性PED（PEDV感染的地方形式）

流行性豬流行性腹瀉

典型的流行性PED導(dǎo)致的詳細(xì)臨床疾病和并發(fā)癥在1976-1977年英國(guó)的血清陰性種豬場(chǎng)、1977年比利時(shí)、1982-1983年日本、2005-2006年意大利、2007-2008年泰國(guó)和2013年美國(guó)均有記載。血清陰性豬場(chǎng)的臨床暴發(fā)特點(diǎn)是所有年齡段的豬突然爆發(fā)嚴(yán)重的腹瀉和/或嘔吐，伴有厭食和食欲顯著下降。

臨床癥狀的嚴(yán)重程度和死亡率似乎與豬的年齡呈負(fù)相關(guān)。在斷奶豬至育肥豬（包括懷孕母豬）中，臨床癥狀在疾病開(kāi)始后5-10天內(nèi)呈自限性，其嚴(yán)重程度不如2周齡以下的哺乳仔豬。當(dāng)懷孕母豬在病毒暴露后獲得免疫力時(shí)，它們通過(guò)乳汁免疫保護(hù)其后代。疾病從開(kāi)始到停止的間隔通常為3-4周，然而臨床癥狀主要在血清陰性的哺乳母豬及其哺乳仔豬中發(fā)生。在分娩豬群中，仔豬發(fā)病率可達(dá)100%，但母豬發(fā)病率各異。2周齡以下仔豬在出現(xiàn)嚴(yán)重水樣腹瀉和/或嘔吐后3-5天，死亡率可超過(guò)95%（平均50%）。

對(duì)1976-1977年英國(guó)（Wood, 1977）和2013年美國(guó)流行性PED的田間觀察以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PEDV在檢測(cè)到臨床癥狀前的潛伏期有所不同，范圍從1到7天（美國(guó)PEDV）或5-8天（英國(guó)PEDV）。使用原型CV777的實(shí)驗(yàn)研究表明，3-15日齡的剖腹產(chǎn)、未食初乳（CDCD）仔豬在PHI 22-36內(nèi)出現(xiàn)腹瀉。另一項(xiàng)美國(guó)PEDV感染研究使用10-35日齡無(wú)菌豬（接種劑量6.3-9.0 log₁₀ GE），顯示嚴(yán)重腹瀉和/或嘔吐通常在PHI 24-48內(nèi)檢測(cè)到。與CDCD或無(wú)菌豬不同，接種中國(guó)PEDV毒株（3.2–3.3 log₁₀ 50%組織培養(yǎng)感染劑量 TCID₅₀）的常規(guī)哺乳仔豬在檢測(cè)到臨床癥狀前有較長(zhǎng)的潛伏期（接種后3-6天）。

地方性PED與細(xì)菌和病毒的混合感染

由地方性PED引起的詳細(xì)臨床疾病和問(wèn)題在1989-1991年荷蘭的一個(gè)自繁自養(yǎng)豬場(chǎng)（farrow-to-finish farm）中有記載。在1989年的暴發(fā)期間，腹瀉在育肥豬和懷孕母豬中最嚴(yán)重，在哺乳和斷奶仔豬中表現(xiàn)輕微或沒(méi)有，且無(wú)死亡。在首次暴發(fā)開(kāi)始后至少18個(gè)月內(nèi)，PEDV在該豬場(chǎng)成為地方性流行，感染持續(xù)存在于新引入的血清陰性后備母豬或6-10周齡豬中。另一種典型的地方性PED已在韓國(guó)養(yǎng)豬場(chǎng)顯現(xiàn)。韓國(guó)豬場(chǎng)使用三種韓國(guó)毒株DR13、KPEDV-9和SM98-1或一種日本毒株P-5V的活疫苗或滅活疫苗。研究報(bào)告稱，近期流行的韓國(guó)PEDV田間分離株與中國(guó)毒株關(guān)系密切，在遺傳上不同于韓國(guó)使用的四種疫苗株和原型CV777。這種歷史疫苗株與近期田間PEDV毒株的分歧可能降低了疫苗效力，導(dǎo)致在韓國(guó)豬群中難以從存在地方性PED的豬場(chǎng)根除PEDV。

與地方性TGE類(lèi)似，被動(dòng)免疫的哺乳仔豬中與PEDV相關(guān)的死亡率和發(fā)病率低于血清陰性豬）。地方性PED主要表現(xiàn)于斷奶豬，哺乳仔豬臨床疾病的嚴(yán)重程度可能因其他腸道病原體的混合感染而加劇，如大腸桿菌（中國(guó)仔豬3%或加拿大仔豬9%），或病毒包括豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）（韓國(guó)仔豬30-33%）、TGEV（中國(guó)仔豬8%）和輪狀病毒（中國(guó)仔豬4%）。

Fig.4. 通過(guò)免疫熒光染色顯示美國(guó)豬流行性腹瀉病毒（PEDV）毒株PC21A接種的無(wú)菌豬小腸中LGR5+隱窩干細(xì)胞的定位。PEDV接種豬在接種后小時(shí)30（臨床癥狀出現(xiàn)后4-5小時(shí)）的空腸，顯示在萎縮絨毛的隱窩細(xì)胞層中有大量LGR5+隱窩干細(xì)胞（紅色染色：箭頭）。原始放大倍數(shù)，×300。使用針對(duì)人LGR5（Novus Biologicals）的多克隆抗體進(jìn)行免疫熒光染色。LGR5+隱窩干細(xì)胞，即LGR5（富含亮氨酸重復(fù)序列的G蛋白偶聯(lián)受體5）陽(yáng)性隱窩基底柱狀細(xì)胞。

病變

大體病變

大體病變僅限于胃腸道，其特征是腸壁（十二指腸至結(jié)腸）變薄透明，腸腔內(nèi)積聚大量黃色液體。胃內(nèi)充滿凝乳，可能是由于腸道蠕動(dòng)減弱所致。經(jīng)常檢測(cè)到腸系膜血管充血，腸系膜淋巴結(jié)（MLN）水腫。常見(jiàn)缺乏腸乳糜管，這是吸收不良的一個(gè)指標(biāo)。盡管持續(xù)嚴(yán)重腹瀉，感染豬在腹瀉開(kāi)始后3-5天仍有低到中度食欲，之后變得瀕死。

組織學(xué)病變

組織學(xué)病變包括急性彌漫性、嚴(yán)重的萎縮性腸炎，以及盲腸和結(jié)腸淺表上皮細(xì)胞的輕度空泡化和上皮下水腫?；陔婄R觀察，四只感染CV777的仔豬中有一只結(jié)腸上皮細(xì)胞有超微結(jié)構(gòu)變化，但缺乏組織學(xué)損傷。

在急性感染期間，在空腸絨毛的頂端或整個(gè)絨毛上可見(jiàn)空泡化的腸細(xì)胞或大量細(xì)胞脫落。萎縮的絨毛常融合在一起，并被退變或再生的扁平上皮覆蓋。固有層中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。十二指腸的李貝昆氏腺（隱窩）表現(xiàn)正常。在經(jīng)口和/或鼻感染的仔豬的脾臟、肝臟、肺、腎臟和MLN中未發(fā)現(xiàn)病變。

在潛伏期，即臨床癥狀出現(xiàn)前，感染豬的絨毛長(zhǎng)度正常，但存在發(fā)生壞死的空泡化腸細(xì)胞。在腹瀉開(kāi)始后1-3天，感染豬表現(xiàn)出嚴(yán)重的絨毛縮短。在感染后期（臨床癥狀出現(xiàn)后84-120小時(shí)）安樂(lè)死的仔豬有中度至重度絨毛萎縮，提示持續(xù)的細(xì)胞壞死。PEDV感染后，腸隱窩層包含LGR5+細(xì)胞（圖4）和對(duì)增殖細(xì)胞標(biāo)志物Ki67蛋白呈陽(yáng)性的隱窩細(xì)胞。PEDV誘導(dǎo)的吸收不良性腹瀉的發(fā)生時(shí)間和嚴(yán)重程度可能取決于空腸絨毛萎縮的程度以及隱窩干細(xì)胞替換的速度。

Fig.5. 通過(guò)免疫熒光染色顯示美國(guó)豬流行性腹瀉病毒（PEDV）毒株PC21A接種的無(wú)菌豬小腸中CD4或CD8陽(yáng)性T細(xì)胞的定位。 (A, B) 臨床癥狀出現(xiàn)后120小時(shí)接種豬的空腸，顯示固有層中有少量到中等數(shù)量的CD4+ (A) 和 CD8+ (B) T細(xì)胞（箭頭）。原始放大倍數(shù)，均為×400。(C) 未接種的陰性對(duì)照豬的空腸，在腸道切片中未檢測(cè)到CD4+ T細(xì)胞。原始放大倍數(shù)，×200。細(xì)胞核用藍(lán)色熒光染料DAPI染色。

免疫預(yù)防作為預(yù)防策略

流行性PED

當(dāng)PED發(fā)生在血清陰性種豬場(chǎng)時(shí)，懷孕母豬的免疫或疫苗接種對(duì)于控制流行性PED和減少哺乳仔豬死亡數(shù)量至關(guān)重要。如果母豬在2周或更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)分娩，可以通過(guò)暴露于強(qiáng)毒自身病毒（如來(lái)自受感染新生仔豬的糞便漿液或切碎的腸道）進(jìn)行免疫。然而，存在潛在風(fēng)險(xiǎn)，即PEDV感染仔豬糞便或腸道中含有的其他致病病毒（如PCV2）可能通過(guò)垂直傳播途徑在母豬或其哺乳仔豬中意外廣泛傳播。通過(guò)乳汁被動(dòng)免疫為新生仔豬提供針對(duì)TGEV感染的即時(shí)保護(hù)的重要性和機(jī)制已由Saif等人（2012）綜述。

歐洲、亞洲和美國(guó)的所有流行性PEDV毒株都具有高度腸道致病性，表現(xiàn)為受感染哺乳仔豬的高死亡率。然而，韓國(guó)（KPEDV-9和DR13）或日本（83P-5）PEDV毒株的毒力可以通過(guò)高代次細(xì)胞培養(yǎng)傳代（93-100代）誘導(dǎo)減弱（。此外，減毒的細(xì)胞適應(yīng)性PEDV毒株已被用作口服（僅韓國(guó)DR13毒株）或肌肉注射（IM）活病毒疫苗。肌肉注射減毒KPEDV-9 PEDV疫苗（1 mL，10⁷ TCID₅₀/mL；分娩前2或4周兩次注射）將接種5個(gè)50%致死劑量（LD50）親本野生型毒株仔豬的40%死亡率降低為0%，將接種10個(gè)LD50仔豬的100%死亡率降低為80%。

其效力可能與疫苗接種母豬血清和初乳中高水平的PEDV特異性IgG有關(guān)。一項(xiàng)使用肌肉注射減毒DR13 PEDV活疫苗（1 mL，10⁷ TCID₅₀/mL；分娩前2或4周兩次注射）的研究，將接種高劑量親本DR13仔豬的100%死亡率降低到60%?；谶@些觀察，懷孕母豬可以通過(guò)肌肉注射途徑使用減毒PEDV毒株進(jìn)行疫苗接種，但未觀察到在哺乳仔豬中誘導(dǎo)完全保護(hù)。

地方性PED

對(duì)哺乳豬或育肥豬進(jìn)行主動(dòng)免疫對(duì)于控制地方性PEDV感染很重要。一項(xiàng)田間研究表明，與肌肉注射途徑相比，在分娩前2或4周兩次口服減毒PEDV（DR13毒株）疫苗在增強(qiáng)或啟動(dòng)懷孕母豬及其哺乳仔豬（3日齡）的免疫力方面更有效。與接種相同劑量肌肉注射疫苗的對(duì)照組相比，接種疫苗的母豬及其仔豬在初乳或血清中表現(xiàn)出更高的IgA（粘膜免疫）和病毒中和抗體（體液免疫）水平。然而，與TGEV感染中觀察到的情況類(lèi)似，接種疫苗豬體內(nèi)母源抗體的存在可能會(huì)干擾PEDV感染后主動(dòng)抗體的產(chǎn)生?？诜钜呙缰暝谶z傳上是否穩(wěn)定且在田間是否保持無(wú)傳染性需要進(jìn)一步研究。

結(jié)論

流行性PED的消失和再次出現(xiàn)表明PEDV能夠有效地逃脫當(dāng)前的疫苗接種方案、生物安全和控制系統(tǒng)。地方性PED是一個(gè)重大問(wèn)題，多種PEDV變異株的出現(xiàn)或潛在輸入到其他國(guó)家加劇了這一問(wèn)題。流行性PEDV毒株傳播迅速，導(dǎo)致大量豬只死亡和重大經(jīng)濟(jì)損失。這些毒株具有高度腸道致病性，會(huì)急性感染整個(gè)小腸和大腸的絨毛上皮細(xì)胞，盡管空腸和回腸是主要感染部位。PEDV感染引起急性、嚴(yán)重的萎縮性腸炎，伴有病毒血癥（病毒RNA），導(dǎo)致嚴(yán)重腹瀉和嘔吐，繼而發(fā)生嚴(yán)重脫水和血液電解質(zhì)失衡，這是哺乳仔豬死亡的主要原因。需要更好地了解流行性或地方性PEDV毒株的致病特征，以在受影響地區(qū)預(yù)防和控制該病，并開(kāi)發(fā)有效的疫苗。

感染PEDV的血清陰性哺乳仔豬的高死亡率最可能與嚴(yán)重絨毛萎縮導(dǎo)致的大量脫水有關(guān)。在受感染的哺乳仔豬中，腸道隱窩細(xì)胞增殖增加，LGR5+隱窩干細(xì)胞數(shù)量增多，受損腸上皮重組，成熟腸細(xì)胞向絨毛頂端遷移，但這些可能不足以防止哺乳仔豬發(fā)生嚴(yán)重脫水。田間PEDV感染哺乳仔豬脫水發(fā)生的時(shí)間似乎太短，使得動(dòng)物無(wú)法通過(guò)隱窩干細(xì)胞自然發(fā)生的上皮細(xì)胞更新從疾病中恢復(fù)。需要進(jìn)一步的研究來(lái)確定哺乳仔豬與斷奶豬腸道干細(xì)胞組織和遷移以替換PEDV感染的絨毛上皮細(xì)胞的程度。促進(jìn)干細(xì)胞再生或成熟的藥理學(xué)或生物學(xué)介質(zhì)，如表皮生長(zhǎng)因子，將是嘗試縮短上皮細(xì)胞更新時(shí)間并減少PEDV脫水死亡損失的有趣靶點(diǎn)。