摘要

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）屬于冠狀病毒科（Coronaviridae）甲型冠狀病毒屬（Alphacoronavirus），在血清陰性新生仔豬中引起急性腹瀉/嘔吐、脫水和高死亡率。在過去的三十年里，PEDV感染給歐洲和亞洲的養(yǎng)豬業(yè)造成了重大經濟損失，但在2013-2014年，該病也在美國、加拿大和墨西哥被報道。從2013年4月至今，美國的PED疫情已導致美國生豬存欄量損失超過10%。

流行性PED的消失和再次出現(xiàn)表明該病毒能夠逃脫當前的疫苗接種方案、生物安全和控制系統(tǒng)。地方性PED是一個重大問題，多種PEDV變異株的出現(xiàn)（或潛在輸入）加劇了這一問題。流行性PEDV毒株傳播迅速，導致大量豬只死亡。這些毒株具有高度腸道致病性，會急性感染整個小腸和大腸的絨毛上皮細胞，但空腸和回腸是主要感染部位。PEDV感染引起急性、嚴重的萎縮性腸炎，伴有病毒血癥，導致嚴重腹瀉和嘔吐，繼而發(fā)生嚴重脫水，這是哺乳仔豬死亡的主要原因。需要全面了解流行性或地方性PEDV毒株的致病特征，以在受影響地區(qū)預防和控制該病，并開發(fā)有效的疫苗。本綜述重點關注PEDV感染的病原學、流行病學、疾病機制、發(fā)病機制以及免疫預防。

引言

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）屬于套式病毒目（Nidovirales）冠狀病毒科（Coronaviridae）甲型冠狀病毒屬（Alphacoronavirus），在新生仔豬中引起急性腹瀉、嘔吐、脫水和高度死亡，導致重大經濟損失。該病最初在過去30年里在歐洲和亞洲的養(yǎng)豬業(yè)中被報道，該病毒最早于20世紀70年代初出現(xiàn)在英格蘭和比利時。最近，PEDV也在美國被報道。此后，該病毒在美國全國范圍內迅速傳播，并傳播到北美其他國家，包括加拿大和墨西哥。由于PEDV的顯著影響，在僅一年的流行期后，美國養(yǎng)豬業(yè)損失了其國內生豬存欄量的近10%，相當于約700萬頭仔豬。

PEDV與另一種甲型冠狀病毒，傳染性胃腸炎病毒（TGEV）之間相似的流行病學和臨床特征導致診斷復雜化，需要進行鑒別性實驗室檢測。自1984年TGEV的一種天然刺突蛋白基因缺失突變體——豬呼吸道冠狀病毒（PRCV）出現(xiàn)以來，由于與TGEV存在交叉保護性免疫，TGEV在PRCV血清陽性的豬群中傳播減少。相比之下，PEDV繼續(xù)在全球傳播并造成經濟問題。

基于遺傳分析，冠狀病毒科可分為四個屬：甲型冠狀病毒屬（Alphacoronavirus）、乙型冠狀病毒屬（Betacoronavirus）、丙型冠狀病毒屬（Gammacoronavirus）和丁型冠狀病毒屬（Deltacoronavirus）。認為蝙蝠是甲型和乙型冠狀病毒的基因來源宿主，而鳥類被認為是丙型和丁型冠狀病毒的疑似宿主。在PEDV流行的美國不同地區(qū)，一種在遺傳上與PEDV不同的新型冠狀病毒——豬丁型冠狀病毒（PDCoV），經常同時出現(xiàn)在豬的腹瀉糞便樣本中。據報道，PDCoV在田間臨床影響和疾病嚴重程度低于PEDV。最近的一項研究證實，PDCoV對豬具有腸道致病性，會急性感染小腸，引起嚴重腹瀉和/或嘔吐以及萎縮性腸炎，其臨床癥狀與PEDV和TGEV感染相似。目前，對PEDV、PDCoV和TGEV的鑒別診斷對于控制美國養(yǎng)豬場病毒性流行性腹瀉至關重要。

本綜述重點關注當前對PEDV的病因學、流行病學、疾病機制、發(fā)病機制的理解以及可用于預防PEDV感染的控制措施。

病原學

PEDV的結構與基因組

PEDV具有包膜，呈多形性，直徑范圍（包括突起）為95-190 nm，突起長度約為18 nm。PEDV結構和基因組的詳細信息可參見其他文獻。PEDV具有一個大小約為28 kb的單股正鏈RNA基因組（不包括poly A尾），編碼四種結構蛋白：刺突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣殼蛋白（N），以及四種非結構蛋白：1a、1b、3a和3b。在病毒蛋白中，S蛋白對于調節(jié)與特定宿主細胞受體糖蛋白的相互作用以介導病毒進入以及誘導中和抗體至關重要。S蛋白還與PEDV在體外的生長適應性及體內毒力的減弱有關。M蛋白是包膜中最豐富的病毒蛋白成分，通過與S蛋白和N蛋白相互作用，在病毒組裝中發(fā)揮重要作用。冠狀病毒的N蛋白結合RNA并將病毒基因組RNA包裝到病毒顆粒的核衣殼中。

PEDV的生物學和理化特性

先前一項使用細胞適應性德國分離株V215/78的研究記錄了PEDV的生物學和理化特性。PEDV的浮力密度為1.18。PEDV易被乙醚或氯仿滅活，與較高溫度相比，在4–50 °C下相對穩(wěn)定。在細胞培養(yǎng)基中于4°C、pH范圍（3-10）下孵育6小時后，PEDV表現(xiàn)出低到中等的殘留感染性；而在37°C下孵育6小時，僅在pH范圍5-8.5之間保留其感染性，在pH < 4 和 > pH 9時病毒完全失活。這些數據表明，如果在較高溫度（>37°C）下應用酸性或堿性消毒劑一定時間，PEDV將被滅活。

PEDV毒株V215/78不能被TGEV抗血清中和。這一發(fā)現(xiàn)得到了另一份報告的支持，該報告通過免疫電鏡和免疫熒光（IF）檢測發(fā)現(xiàn)，PEDV CV777毒株與比利時TGEV毒株或貓傳染性腹膜炎病毒（FIPV）均無交叉反應性。然而，隨后的研究發(fā)現(xiàn)，通過更靈敏的檢測方法，如酶聯(lián)免疫吸附試驗、免疫印跡和免疫沉淀，PEDV和FIPV之間存在可檢測的雙向交叉反應性。這些差異表明，PEDV與其他冠狀病毒之間的交叉反應性可能因技術靈敏度和測試的病毒株而異。最近的一項研究報告了原型CV777和近期美國PEDV毒株與TGEV（Miller毒株）之間存在抗原交叉活性的證據，因為它們在其N蛋白的N末端區(qū)域至少共享一個保守表位。

PEDV的滅活

Pospischil等人（2002）證明PEDV可被消毒劑滅活，即氧化劑（Virkon S）、漂白劑、酚類化合物（One-Stroke Environ; Tek-Trol）、2%氫氧化鈉、甲醛和戊二醛、碳酸鈉（4%無水或10%結晶，含0.1%洗滌劑）、離子和非離子洗滌劑、1%強效碘伏（溶于磷酸中）以及脂溶劑如氯仿。

用于病毒分離的細胞培養(yǎng)

Vero（非洲綠猴腎）細胞支持在補充有外源性蛋白酶胰蛋白酶的細胞培養(yǎng)物中分離和連續(xù)傳代培養(yǎng)PEDV。另一種非洲綠猴腎細胞系MARC-145也支持PEDV的后續(xù)細胞傳代。胰蛋白酶在PEDV病毒粒子進入Vero細胞和釋放中發(fā)揮重要作用，有助于病毒在體外有效復制并傳播到鄰近細胞。胰蛋白酶導致S蛋白裂解為S1和S2亞基，這很可能是細胞間融合以及病毒粒子從感染的Vero細胞中釋放的原因。細胞病變效應包括空泡化和合胞體形成，這是細胞凋亡性死亡的結果。PEDV的血凝活性僅在胰蛋白酶處理后才能在兔紅細胞上得到證實。不同國家報道的PEDV只有一個血清型。

流行病學

PEDV全球流行病學

PEDV最早于20世紀70年代初出現(xiàn)在英國（Wood, 1977）和比利時。該病毒于1977年在比利時首次分離，并被歸類于冠狀病毒科。隨后，在20世紀80年代和90年代，PEDV在日本和韓國被確認為是造成嚴重流行的原因。盡管廣泛應用了PEDV疫苗，PED在韓國仍然呈地方性流行。

在20世紀80年代和90年代的歐洲，PED暴發(fā)并不頻繁，但該病毒繼續(xù)傳播并以地方性形式在豬群中持續(xù)存在。隨后的血清學調查顯示歐洲豬群中PEDV的流行率為低到中度。然后，歐洲豬群中PEDV的流行率大幅下降，盡管原因尚不清楚。PED的暴發(fā)在歐洲僅零星觀察到：1989-1991年在荷蘭；1995年在匈牙利，以及1998年在英格蘭。然而，2005-2006年在意大利發(fā)現(xiàn)了一次典型的流行性PED暴發(fā)。

2007-2008年在泰國，報道了幾次嚴重的PED暴發(fā)，其泰國PEDV分離株在系統(tǒng)發(fā)育上與中國的JS-2004-2毒株屬于同一分支。這種新基因型的PEDV繼續(xù)在泰國引起零星暴發(fā)。

2010-2012年在中國，不同地區(qū)報道了血清陽性豬群中嚴重的PED暴發(fā)。自PEDV首次在中國出現(xiàn)近二十年來，許多豬群都接種了原型毒株CV777滅活疫苗或相關疫苗。然而，接種疫苗豬群中哺乳仔豬的中到高度死亡率表明CV777疫苗有效性較低。2010-2012年中國的PED暴發(fā)是由經典的和新的PEDV變異株共同引起的，這些變異株在遺傳上不同于原型CV777。

2013-2014年美國PEDV分子流行病學

2013年首次暴發(fā)期間鑒定的美國PEDV毒株在遺傳上與2011-2012年報道的中國毒株（China/2012/AH2012）密切相關，表明類似AH2012的中國PEDV毒株在美國出現(xiàn)。類似美國的PEDV毒株也在2013年末和2014年初在韓國和臺灣的腹瀉仔豬中發(fā)現(xiàn)，但中國或美國的PEDV毒株是否可能傳播到韓國和臺灣的豬尚不清楚。需要進一步調查以澄清在相關暴發(fā)首次被發(fā)現(xiàn)之前，中國或美國的PEDV毒株是否已經存在于韓國和臺灣。

首次暴發(fā)后不到一年，發(fā)現(xiàn)了其他新型美國PEDV毒株（OH/OH851），其S基因存在多處缺失和插入，與中國的HBQX-2010或CH/ZMZDY/11毒株關系密切，而非AH2012。與主要的美國PEDV毒株相比，這些毒株在5'端S1區(qū)域（前1170個核苷酸）具有較低的核苷酸同源性，而在剩余的S基因中具有較高的核苷酸同源性。涉及中國毒株的可能的重組事件可能促進了美國PEDV的快速進化和多種變異株的出現(xiàn)，使美國PEDV毒株的分子流行病學復雜化。

值得注意的是，首次暴發(fā)僅一年后，出現(xiàn)了另一種PEDV變異株，該變異株在主要細胞培養(yǎng)的美國PEDV毒株（如PEDV毒株TC-PC22A，GenBank登錄號KM392224）的S蛋白N端部分存在一個大的197個氨基酸（aa）缺失。在韓國PEDV毒株中也鑒定出另一種在S蛋白713-916位點存在大片段（204 aa）缺失的PEDV變異株。

傳播

糞-口途徑是PEDV傳播的主要方式，盡管氣溶膠化的PEDV仍具有感染性。腹瀉糞便和/或嘔吐物以及其他受污染的污染物，如運輸拖車和飼料，可能是該病毒的主要傳播源。PEDV的另一個可能的儲存庫包括攜帶者，例如無癥狀感染的年長豬，病毒在其中以亞臨床方式傳播。

先前的研究顯示，在受感染的哺乳母豬的乳汁樣本中，PEDV RNA的檢出率較低到中等（23-41%），表明母豬乳汁可能是PEDV垂直傳播的潛在途徑。我們的研究表明，在實驗感染仔豬或自然感染生長豬的急性期血清樣本中，PEDV RNA的檢出率顯著（55-100%）。用作飼料添加劑的豬血漿是否可能是PEDV的傳播源仍有疑問，因為兩項不同的感染研究報道了不一致的結果，這些研究調查了檢測出PEDV RNA陽性的噴霧干燥豬血漿是否對血清陰性豬具有傳染性。

PEDV的疾病機制與發(fā)病機制

PEDV的組織嗜性

豬小腸絨毛腸細胞大量表達氨肽酶N（APN），這是一種150-kDa的糖基化跨膜蛋白，被鑒定為PEDV的細胞受體。腸細胞上高密度的受體使PEDV能夠通過病毒-受體相互作用進入并復制。PEDV具有細胞溶解性，受感染的腸細胞迅速發(fā)生急性壞死，導致小腸（而非大腸）出現(xiàn)顯著的絨毛萎縮（圖1A）。PEDV抗原主要在小腸（十二指腸至回腸）（圖1B）和大腸（直腸除外）的絨毛腸細胞中觀察到。

與TGEV類似，PEDV可能不會誘導感染豬小腸腸細胞的凋亡性死亡（圖1C, D）。在感染后期，偶爾在腸隱窩細胞或派伊爾氏結中檢測到少量PEDV陽性細胞。在我們的初步研究中，無菌豬在接種后小時（PHI）30-72時，每個腸絨毛的平均杯狀細胞數量（<2個/絨毛）少于陰性對照豬（6-18個/絨毛）（圖2）。

與TGEV類似，PEDV可能感染杯狀細胞，導致腹瀉早期該細胞類型數量急劇減少。杯狀細胞分泌粘蛋白，提供腸道抵抗微生物的第一道防線。經口鼻感染的豬的肺組織PEDV抗原呈陰性，表明下呼吸道沒有PEDV復制的證據。在其他主要器官，如幽門、扁桃體、脾臟、肝臟和腎臟中未檢測到PEDV抗原。然而，最近的一項研究報道了PEDV在豬肺巨噬細胞中的體外和體內復制。仍不確定PEDV是否發(fā)生腸外復制。

疾病進展過程中PEDV在腸道的復制

PEDV結合并感染表達APN的腸細胞。病毒在受感染的腸細胞中通過內質網和高爾基體等胞質內膜出芽迅速組裝。在潛伏期，整個小腸可見PEDV抗原陽性細胞，多達30-50%的吸收上皮細胞呈陽性，這與感染急性期無癥狀豬的糞便排毒一致。從感染的急性期到中期（臨床癥狀出現(xiàn)后24-60小時），整個小腸和大腸可見中等到大量的PEDV抗原陽性細胞，常累及整個絨毛上皮。在感染后期（臨床癥狀出現(xiàn)后>72小時），仍觀察到大量PEDV感染的上皮細胞，提示PEDV對再生的腸細胞存在再感染。

病理生理學

PEDV引起的腹瀉是由于大量吸收性腸細胞損失導致的吸收不良的結果。受感染腸細胞的功能障礙也促成了吸收不良性腹瀉。在電鏡下檢查受感染的腸細胞，細胞質電子密度降低和線粒體快速變性導致吸收所需的轉運能量缺乏。在受感染的結腸上皮細胞中觀察到的超微結構變化和輕度空泡化可能干擾水和電解質的重要重吸收。嘔吐加劇了脫水，但PEDV感染誘發(fā)嘔吐的機制尚不清楚。

類似于急性TGEV感染中的高鉀血癥和酸中毒，我們的初步研究表明，在出現(xiàn)嚴重水樣腹瀉后1天，接種PEDV的仔豬表現(xiàn)出高鈉血癥、高鉀血癥和高氯血癥，但鈣和碳酸氫鹽水平低。腹瀉仔豬小腸中刷狀緣膜結合的消化酶，如雙糖酶（乳糖酶、蔗糖酶、和麥芽糖酶）、亮氨酸APN和堿性磷酸酶顯著降低。小腸中酶活性的降低導致消化不良性腹瀉。在我們的初步研究中，在PHI 30-120時，受感染無菌豬的小腸中觀察到緊密連接蛋白（ZO-1）和粘附連接蛋白（E-鈣粘蛋白）的分布紊亂、不規(guī)則以及表達減少（圖3）。受損的腸道完整性可能導致水分因PEDV感染引起的高滲透壓而流失到腸腔，并攝取腸腔細菌引起混合感染。

Fig. 1.接種美國PEDV株PC 21 A的無菌豬的腸道中的組織病理學、通過免疫熒光染色定位豬流行性腹瀉病毒（PEDV）抗原，以及通過原位端粒檢測的細胞死亡。(A)接種后46小時（出現(xiàn)臨床體征時），接種豬的經莫林和伊紅（H & E）染色的腸，顯示急性彌漫性、嚴重萎縮性甲狀腺炎，絨毛高度與陰囊深度之比（VH：CD）& T &原始放大倍數x 200。(B)PIH 30（出現(xiàn)臨床癥狀后4-5小時）接種豬的腸免疫熒光（IF）染色，顯示萎縮絨毛內襯的表皮細胞PEDV抗原呈陽性。原始放大倍數x 200。(C)與D組（陰性對照）相比，對接種豬福爾馬林固定的、蠟包埋的腸進行原位TLR染色（B組），顯示通過IF染色對PEDV抗原呈陽性的內皮萎縮絨毛中的TLR陽性（細胞死亡）細胞（紅色染色）沒有增加。原始放大倍數x 200。(D)對未接種的陰性對照豬的福爾馬林固定、蠟包埋的腸腸絨毛皮中進行原位TLR染色，顯示腸絨毛皮中很少有TLR陽性（細胞死亡）細胞（紅色染色）。注意固有層中有一些TLR陽性細胞（紅色染色）。原始放大倍數x 200。IL，腸腔。在B組中，細胞核用藍色熒光4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽染色。TLR，原位末端去氧核苷轉移酶修飾的dGPT缺口末端標記。

PED的抵抗力與日齡關系

PEDV感染在哺乳仔豬中比在斷奶豬中誘導更嚴重的疾病和死亡的機制尚未明確闡明。幾個可能影響哺乳仔豬對PEDV感染易感性更高和疾病恢復時間更長的解剖學和生理學因素包括：新生仔豬腸細胞更新較慢（5-7天），而3周齡斷奶豬為2-3天。

腸道上皮的高更新率依賴于在腸隱窩中發(fā)現(xiàn)的干細胞。腸道干細胞主要包括三種細胞類型：LGR5（富含亮氨酸重復序列的G蛋白偶聯(lián)受體5）陽性隱窩基底柱狀細胞（LGR5+細胞）、+4細胞和潘氏細胞（Paneth cells）。然而，豬腸道中是否存在潘氏細胞存在爭議。

我們的初步研究揭示了在PEDV感染豬的隱窩細胞層中存在大量LGR5+細胞（圖4），表明存在對PEDV感染急性期上皮細胞更新至關重要的干細胞。該研究還揭示了在未感染PEDV的哺乳仔豬（9日齡）小腸中缺乏LGR5+細胞且隱窩細胞增殖低下（隱窩細胞中Ki67蛋白表達少），可能導致腸細胞更新緩慢。然而，在PEDV感染后3-5天，LGR5+細胞的數量和隱窩細胞的增殖顯著增加，導致替換從受感染絨毛脫落的壞死腸細胞。另一方面，未感染PEDV的斷奶豬（3周齡）表現(xiàn)出高隱窩細胞增殖能力和隱窩中存在大量LGR5+細胞，這與腸細胞的快速更新率有關。大量的LGR5+細胞和隱窩細胞的高繁殖得以維持，可能導致斷奶豬從PED中迅速恢復。

圖2。通過甲氧胺藍染色確定，接種美國豬流行性腹瀉病毒（PEDV）株PC 21 A的無菌豬的小腸杯狀細胞數量減少。(A)接種后72小時（出現(xiàn)臨床癥狀后26-28小時）接種豬的甲狀腺，每個絨毛顯示很少有杯狀細胞。原始放大倍數，x 200。(B)陰性對照豬的甲狀腺，每個絨毛顯示少量至中等數量的杯狀細胞（箭頭）。原始放大倍數，x 200。(C)PIH 72（出現(xiàn)臨床癥狀后26-28小時）接種豬的免疫結果，每個絨毛顯示很少有杯狀細胞。原始放大倍數，x 80。(D)陰性對照豬的圖像，顯示每個絨毛中有中等至大量的杯狀細胞（箭頭）。原始放大倍數，x 80。

病毒血癥

在接種美國PEDV毒株（PC21A）的無菌仔豬感染急性期至后期階段檢測到病毒血癥，血清中病毒RNA范圍在4.8至7.6 log₁₀基因組當量（GE）/mL之間。在田間樣本中也觀察到類似結果，顯示從13-20周齡腹瀉豬收集的20份急性期血清樣本中有11份（55%）含有病毒RNA滴度（4.0–6.3 log₁₀ GE/mL）。早期嚴重的腹瀉/嘔吐和高PEDV糞便排毒滴度可能伴隨病毒血癥，但尚未有人證實在血清中存在感染性病毒。

對PEDV的免疫反應

關于對PEDV的先天性和適應性免疫反應的信息匱乏。PEDV感染后，在小腸固有層中觀察到淋巴細胞（在PHI 30-120時為CD4+和CD8+ T細胞）（圖5）、單核細胞、嗜酸性粒細胞和中性粒細胞的浸潤。在接種CV777毒株的常規(guī)豬中研究了全身和粘膜相關淋巴組織中的同種型特異性抗體分泌細胞以及血清抗體反應。表達PEDV E蛋白的培養(yǎng)腸上皮細胞在體外上調白細胞介素（IL）-8的表達。

PEDV的減毒

流行性PEDV毒株的致病性通常很嚴重，表現(xiàn)為受感染哺乳仔豬的高死亡率。然而，通過高代次細胞培養(yǎng)傳代（93-100代）引起PEDV毒株的毒力減弱。與其親本野生型毒株相比，減毒的PEDV毒株在其S基因和開放閱讀框3（ORF3）基因中存在多處核苷酸變化。在ORF3的652個核苷酸中，在親本野生型DR13 PEDV和經細胞傳代適應（100代）并被證實減毒的PEDV之間鑒定出兩個缺失和七個變化。值得注意的是，兩種減毒PEDV毒株——韓國DR13（100代）和日本83P-5（100代）的S基因與其親本病毒相比，具有顯著相似性，存在可比的核苷酸突變和氨基酸（aa）替換。減毒的83P-5在S基因中有18個核苷酸突變和13個預測的aa替換。

同樣，對美國PEDV毒株和體外傳代病毒（在MARC-145細胞中傳10代）的序列分析表明，細胞培養(yǎng)適應過程特異性地修飾了PEDV S蛋白（6個aa替換）而開放閱讀框1a/b（ORF1a/b）編碼的多聚蛋白、ORF3、E、M和N蛋白保持不變。PEDV S基因中的多處核苷酸突變和aa替換可能有助于其體內致病性的減弱，但需要對整個PEDV基因組進行測序以驗證減毒后的其他變化。

Fig.3. 通過免疫熒光染色顯示美國豬流行性腹瀉病毒（PEDV）PC21A接種的無菌豬小腸中緊密連接蛋白（ZO-1）（A, B）和粘附連接蛋白（E-鈣粘蛋白）（C, D）的表達。(A) 陰性對照豬的空腸，顯示絨毛上皮細胞頂表面ZO-1（綠色染色）分布良好、表達廣泛。原始放大倍數，×400。(B) 接種豬在接種后小時（PHI）30（臨床癥狀出現(xiàn)后4-5小時）的空腸，顯示與陰性對照（圖A）相比，絨毛上皮細胞頂表面ZO-1（綠色染色）分布紊亂、不規(guī)則，表達中度減少。原始放大倍數，×400。(C) 陰性對照豬的空腸，顯示絨毛上皮細胞頂表面和基底外側表面以及細胞質中輕度表達的E-鈣粘蛋白（綠色染色）分布良好、表達廣泛。原始放大倍數，×600。(D) 接種豬在PHI 30（臨床癥狀出現(xiàn)后4-5小時）的空腸，顯示與陰性對照（圖C）相比，絨毛上皮細胞頂表面和基底外側表面的E-鈣粘蛋白（綠色染色）分布紊亂、不規(guī)則，表達中度減少。原始放大倍數，×600。細胞核用藍色熒光染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽（DAPI）染色。使用針對人重組ZO-1和E-鈣粘蛋白（Invitrogen）的單克隆抗體進行免疫熒光染色。

流行性PED（PEDV感染的流行形式）與地方性PED（PEDV感染的地方形式）

流行性豬流行性腹瀉

典型的流行性PED導致的詳細臨床疾病和并發(fā)癥在1976-1977年英國的血清陰性種豬場、1977年比利時、1982-1983年日本、2005-2006年意大利、2007-2008年泰國和2013年美國均有記載。血清陰性豬場的臨床暴發(fā)特點是所有年齡段的豬突然爆發(fā)嚴重的腹瀉和/或嘔吐，伴有厭食和食欲顯著下降。

臨床癥狀的嚴重程度和死亡率似乎與豬的年齡呈負相關。在斷奶豬至育肥豬（包括懷孕母豬）中，臨床癥狀在疾病開始后5-10天內呈自限性，其嚴重程度不如2周齡以下的哺乳仔豬。當懷孕母豬在病毒暴露后獲得免疫力時，它們通過乳汁免疫保護其后代。疾病從開始到停止的間隔通常為3-4周，然而臨床癥狀主要在血清陰性的哺乳母豬及其哺乳仔豬中發(fā)生。在分娩豬群中，仔豬發(fā)病率可達100%，但母豬發(fā)病率各異。2周齡以下仔豬在出現(xiàn)嚴重水樣腹瀉和/或嘔吐后3-5天，死亡率可超過95%（平均50%）。

對1976-1977年英國（Wood, 1977）和2013年美國流行性PED的田間觀察以及實驗結果表明，PEDV在檢測到臨床癥狀前的潛伏期有所不同，范圍從1到7天（美國PEDV）或5-8天（英國PEDV）。使用原型CV777的實驗研究表明，3-15日齡的剖腹產、未食初乳（CDCD）仔豬在PHI 22-36內出現(xiàn)腹瀉。另一項美國PEDV感染研究使用10-35日齡無菌豬（接種劑量6.3-9.0 log₁₀ GE），顯示嚴重腹瀉和/或嘔吐通常在PHI 24-48內檢測到。與CDCD或無菌豬不同，接種中國PEDV毒株（3.2–3.3 log₁₀ 50%組織培養(yǎng)感染劑量 TCID₅₀）的常規(guī)哺乳仔豬在檢測到臨床癥狀前有較長的潛伏期（接種后3-6天）。

地方性PED與細菌和病毒的混合感染

由地方性PED引起的詳細臨床疾病和問題在1989-1991年荷蘭的一個自繁自養(yǎng)豬場（farrow-to-finish farm）中有記載。在1989年的暴發(fā)期間，腹瀉在育肥豬和懷孕母豬中最嚴重，在哺乳和斷奶仔豬中表現(xiàn)輕微或沒有，且無死亡。在首次暴發(fā)開始后至少18個月內，PEDV在該豬場成為地方性流行，感染持續(xù)存在于新引入的血清陰性后備母豬或6-10周齡豬中。另一種典型的地方性PED已在韓國養(yǎng)豬場顯現(xiàn)。韓國豬場使用三種韓國毒株DR13、KPEDV-9和SM98-1或一種日本毒株P-5V的活疫苗或滅活疫苗。研究報告稱，近期流行的韓國PEDV田間分離株與中國毒株關系密切，在遺傳上不同于韓國使用的四種疫苗株和原型CV777。這種歷史疫苗株與近期田間PEDV毒株的分歧可能降低了疫苗效力，導致在韓國豬群中難以從存在地方性PED的豬場根除PEDV。

與地方性TGE類似，被動免疫的哺乳仔豬中與PEDV相關的死亡率和發(fā)病率低于血清陰性豬）。地方性PED主要表現(xiàn)于斷奶豬，哺乳仔豬臨床疾病的嚴重程度可能因其他腸道病原體的混合感染而加劇，如大腸桿菌（中國仔豬3%或加拿大仔豬9%），或病毒包括豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）（韓國仔豬30-33%）、TGEV（中國仔豬8%）和輪狀病毒（中國仔豬4%）。

Fig.4. 通過免疫熒光染色顯示美國豬流行性腹瀉病毒（PEDV）毒株PC21A接種的無菌豬小腸中LGR5+隱窩干細胞的定位。PEDV接種豬在接種后小時30（臨床癥狀出現(xiàn)后4-5小時）的空腸，顯示在萎縮絨毛的隱窩細胞層中有大量LGR5+隱窩干細胞（紅色染色：箭頭）。原始放大倍數，×300。使用針對人LGR5（Novus Biologicals）的多克隆抗體進行免疫熒光染色。LGR5+隱窩干細胞，即LGR5（富含亮氨酸重復序列的G蛋白偶聯(lián)受體5）陽性隱窩基底柱狀細胞。

病變

大體病變

大體病變僅限于胃腸道，其特征是腸壁（十二指腸至結腸）變薄透明，腸腔內積聚大量黃色液體。胃內充滿凝乳，可能是由于腸道蠕動減弱所致。經常檢測到腸系膜血管充血，腸系膜淋巴結（MLN）水腫。常見缺乏腸乳糜管，這是吸收不良的一個指標。盡管持續(xù)嚴重腹瀉，感染豬在腹瀉開始后3-5天仍有低到中度食欲，之后變得瀕死。

組織學病變

組織學病變包括急性彌漫性、嚴重的萎縮性腸炎，以及盲腸和結腸淺表上皮細胞的輕度空泡化和上皮下水腫。基于電鏡觀察，四只感染CV777的仔豬中有一只結腸上皮細胞有超微結構變化，但缺乏組織學損傷。

在急性感染期間，在空腸絨毛的頂端或整個絨毛上可見空泡化的腸細胞或大量細胞脫落。萎縮的絨毛常融合在一起，并被退變或再生的扁平上皮覆蓋。固有層中炎癥細胞浸潤明顯。十二指腸的李貝昆氏腺（隱窩）表現(xiàn)正常。在經口和/或鼻感染的仔豬的脾臟、肝臟、肺、腎臟和MLN中未發(fā)現(xiàn)病變。

在潛伏期，即臨床癥狀出現(xiàn)前，感染豬的絨毛長度正常，但存在發(fā)生壞死的空泡化腸細胞。在腹瀉開始后1-3天，感染豬表現(xiàn)出嚴重的絨毛縮短。在感染后期（臨床癥狀出現(xiàn)后84-120小時）安樂死的仔豬有中度至重度絨毛萎縮，提示持續(xù)的細胞壞死。PEDV感染后，腸隱窩層包含LGR5+細胞（圖4）和對增殖細胞標志物Ki67蛋白呈陽性的隱窩細胞。PEDV誘導的吸收不良性腹瀉的發(fā)生時間和嚴重程度可能取決于空腸絨毛萎縮的程度以及隱窩干細胞替換的速度。

Fig.5. 通過免疫熒光染色顯示美國豬流行性腹瀉病毒（PEDV）毒株PC21A接種的無菌豬小腸中CD4或CD8陽性T細胞的定位。 (A, B) 臨床癥狀出現(xiàn)后120小時接種豬的空腸，顯示固有層中有少量到中等數量的CD4+ (A) 和 CD8+ (B) T細胞（箭頭）。原始放大倍數，均為×400。(C) 未接種的陰性對照豬的空腸，在腸道切片中未檢測到CD4+ T細胞。原始放大倍數，×200。細胞核用藍色熒光染料DAPI染色。

免疫預防作為預防策略

流行性PED

當PED發(fā)生在血清陰性種豬場時，懷孕母豬的免疫或疫苗接種對于控制流行性PED和減少哺乳仔豬死亡數量至關重要。如果母豬在2周或更長時間內分娩，可以通過暴露于強毒自身病毒（如來自受感染新生仔豬的糞便漿液或切碎的腸道）進行免疫。然而，存在潛在風險，即PEDV感染仔豬糞便或腸道中含有的其他致病病毒（如PCV2）可能通過垂直傳播途徑在母豬或其哺乳仔豬中意外廣泛傳播。通過乳汁被動免疫為新生仔豬提供針對TGEV感染的即時保護的重要性和機制已由Saif等人（2012）綜述。

歐洲、亞洲和美國的所有流行性PEDV毒株都具有高度腸道致病性，表現(xiàn)為受感染哺乳仔豬的高死亡率。然而，韓國（KPEDV-9和DR13）或日本（83P-5）PEDV毒株的毒力可以通過高代次細胞培養(yǎng)傳代（93-100代）誘導減弱（。此外，減毒的細胞適應性PEDV毒株已被用作口服（僅韓國DR13毒株）或肌肉注射（IM）活病毒疫苗。肌肉注射減毒KPEDV-9 PEDV疫苗（1 mL，10⁷ TCID₅₀/mL；分娩前2或4周兩次注射）將接種5個50%致死劑量（LD50）親本野生型毒株仔豬的40%死亡率降低為0%，將接種10個LD50仔豬的100%死亡率降低為80%。

其效力可能與疫苗接種母豬血清和初乳中高水平的PEDV特異性IgG有關。一項使用肌肉注射減毒DR13 PEDV活疫苗（1 mL，10⁷ TCID₅₀/mL；分娩前2或4周兩次注射）的研究，將接種高劑量親本DR13仔豬的100%死亡率降低到60%?；谶@些觀察，懷孕母豬可以通過肌肉注射途徑使用減毒PEDV毒株進行疫苗接種，但未觀察到在哺乳仔豬中誘導完全保護。

地方性PED

對哺乳豬或育肥豬進行主動免疫對于控制地方性PEDV感染很重要。一項田間研究表明，與肌肉注射途徑相比，在分娩前2或4周兩次口服減毒PEDV（DR13毒株）疫苗在增強或啟動懷孕母豬及其哺乳仔豬（3日齡）的免疫力方面更有效。與接種相同劑量肌肉注射疫苗的對照組相比，接種疫苗的母豬及其仔豬在初乳或血清中表現(xiàn)出更高的IgA（粘膜免疫）和病毒中和抗體（體液免疫）水平。然而，與TGEV感染中觀察到的情況類似，接種疫苗豬體內母源抗體的存在可能會干擾PEDV感染后主動抗體的產生?？诜钜呙缰暝谶z傳上是否穩(wěn)定且在田間是否保持無傳染性需要進一步研究。

結論

流行性PED的消失和再次出現(xiàn)表明PEDV能夠有效地逃脫當前的疫苗接種方案、生物安全和控制系統(tǒng)。地方性PED是一個重大問題，多種PEDV變異株的出現(xiàn)或潛在輸入到其他國家加劇了這一問題。流行性PEDV毒株傳播迅速，導致大量豬只死亡和重大經濟損失。這些毒株具有高度腸道致病性，會急性感染整個小腸和大腸的絨毛上皮細胞，盡管空腸和回腸是主要感染部位。PEDV感染引起急性、嚴重的萎縮性腸炎，伴有病毒血癥（病毒RNA），導致嚴重腹瀉和嘔吐，繼而發(fā)生嚴重脫水和血液電解質失衡，這是哺乳仔豬死亡的主要原因。需要更好地了解流行性或地方性PEDV毒株的致病特征，以在受影響地區(qū)預防和控制該病，并開發(fā)有效的疫苗。

感染PEDV的血清陰性哺乳仔豬的高死亡率最可能與嚴重絨毛萎縮導致的大量脫水有關。在受感染的哺乳仔豬中，腸道隱窩細胞增殖增加，LGR5+隱窩干細胞數量增多，受損腸上皮重組，成熟腸細胞向絨毛頂端遷移，但這些可能不足以防止哺乳仔豬發(fā)生嚴重脫水。田間PEDV感染哺乳仔豬脫水發(fā)生的時間似乎太短，使得動物無法通過隱窩干細胞自然發(fā)生的上皮細胞更新從疾病中恢復。需要進一步的研究來確定哺乳仔豬與斷奶豬腸道干細胞組織和遷移以替換PEDV感染的絨毛上皮細胞的程度。促進干細胞再生或成熟的藥理學或生物學介質，如表皮生長因子，將是嘗試縮短上皮細胞更新時間并減少PEDV脫水死亡損失的有趣靶點。