摘要

獸用疫苗需要具備理想的特性，如高效、廉價(jià)、易于接種、適合大規(guī)模接種以及在田間條件下穩(wěn)定等。DNA疫苗作為亞單位疫苗，不存在感染風(fēng)險(xiǎn)或毒力返強(qiáng)的問(wèn)題，被認(rèn)為是解決禽類(lèi)疾病的潛在方案。DNA疫苗可用于同時(shí)針對(duì)多種病原體進(jìn)行免疫，且設(shè)計(jì)相對(duì)簡(jiǎn)單、生產(chǎn)和儲(chǔ)存成本較低。在不同的動(dòng)物模型中，DNA疫苗的接種已被證明能激發(fā)免疫應(yīng)答，并對(duì)病原體的攻擊提供保護(hù)。盡管DNA疫苗具有諸多優(yōu)勢(shì)，但它存在無(wú)法誘導(dǎo)強(qiáng)效免疫以及目前不適用于大規(guī)模接種等問(wèn)題，這阻礙了其在禽類(lèi)產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用。有人提出使用生物載體或物理載體來(lái)克服當(dāng)前DNA疫苗在獸用領(lǐng)域的遞送限制。本文綜述了禽類(lèi)病原體獸用DNA疫苗載體的最新研究進(jìn)展。

 1. 引言

疫苗能有效對(duì)抗動(dòng)物傳染病，并成功控制和/或根除了主要的動(dòng)物病原體。根據(jù)英國(guó)皇家學(xué)會(huì)2002年關(guān)于家畜傳染病的報(bào)告提出的指南，理想疫苗應(yīng)具備以下特性：

- 提供廣譜保護(hù)，抵御所有受感染物種中的所有病毒分離株，防止帶毒、排毒和傳播的可能性；

- 激發(fā)足夠水平的免疫力，以產(chǎn)生有效且持久的免疫應(yīng)答；

- 生產(chǎn)費(fèi)用低且易于接種；

- 對(duì)于減毒活疫苗，必須避免毒力返強(qiáng)；

- 保質(zhì)期長(zhǎng)且耐熱穩(wěn)定；

- 能夠區(qū)分感染動(dòng)物和接種疫苗的動(dòng)物；

- 提供較強(qiáng)水平的母源免疫力。

然而，目前尚無(wú)一種疫苗能完全具備上述所有特性。使用疫苗控制疾病的依據(jù)是評(píng)估接種后的風(fēng)險(xiǎn)和收益。通常，基因疫苗由DNA（如質(zhì)粒）或RNA（如mRNA）組成，接種動(dòng)物的細(xì)胞會(huì)攝取并將其翻譯成蛋白質(zhì)。由于關(guān)于RNA疫苗的報(bào)道有限，而有關(guān)DNA疫苗的文獻(xiàn)廣泛，因此基因疫苗通常被稱為質(zhì)粒DNA抗原表達(dá)系統(tǒng)?；蛎庖撸卜Q為DNA免疫，是一種利用編碼抗原的真核表達(dá)載體的新型疫苗技術(shù)。

沃爾夫等人首次證明，在小鼠模型中，直接肌內(nèi)注射質(zhì)粒DNA能夠使質(zhì)粒編碼的抗原得到表達(dá)。迄今為止，DNA疫苗已被成功批準(zhǔn)用于預(yù)防馬的西尼羅河病毒、養(yǎng)殖鮭魚(yú)的傳染性造血壞死病、犬的黑色素瘤，以及大西洋鮭魚(yú)的胰腺疾病感染（Clynav）。此外，美國(guó)農(nóng)業(yè)部（USDA）最近有條件地批準(zhǔn)了首個(gè)針對(duì)雞的H5N1 DNA疫苗，該疫苗針對(duì)高致病性H5禽流感。

1993年，首個(gè)在禽類(lèi)中研究的DNA疫苗是針對(duì)禽流感病毒（AIV）的。DNA疫苗的免疫接種取得了一些成功，這可能歸功于其相對(duì)于傳統(tǒng)疫苗的優(yōu)勢(shì)。盡管一些DNA疫苗在獸用小型動(dòng)物模型中取得了成功，但在大型動(dòng)物模型中仍存在質(zhì)粒遞送和免疫原性不足的問(wèn)題。為了提高DNA疫苗的免疫原性，已在體內(nèi)與DNA疫苗共同施用佐劑。還可以將免疫調(diào)節(jié)佐劑整合到質(zhì)粒中，并共表達(dá)佐劑基因。研究發(fā)現(xiàn)，免疫調(diào)節(jié)基因，包括細(xì)胞因子（IL15、IL18）、Esat-1、MDP-1、HMGB1ΔC或HSP70，能夠增強(qiáng)AIV DNA疫苗的體液和細(xì)胞免疫。此外，近年來(lái)在質(zhì)粒攜帶抗原的優(yōu)化、新型遞送方法（如電穿孔或噴射注射）、抗原靶向抗原呈遞細(xì)胞（APCs）以及與生物載體和納米顆粒載體共同遞送等方面的進(jìn)展，顯著提高了DNA疫苗在禽類(lèi)中的效力。

禽類(lèi)DNA疫苗已被開(kāi)發(fā)用于對(duì)抗多種病毒、細(xì)菌和原生動(dòng)物疾病。研究取得了令人鼓舞的結(jié)果，并能對(duì)禽類(lèi)疾病產(chǎn)生100%的完全保護(hù)，例如雞和鵪鶉中的AIV、鴨坦布蘇病毒（DTMUV）、雞的傳染性法氏囊病病毒（IBDV）和新城疫病毒（NDV）（表1）。根據(jù)表1中的數(shù)據(jù)匯總，約76%的禽類(lèi)DNA疫苗用于雞，13%用于鴨，9%用于火雞，僅2%用于鵪鶉（圖1A）。禽類(lèi)DNA疫苗的效力受宿主日齡、接種次數(shù)、載體和佐劑、不同遞送途徑以及對(duì)不同病原體的免疫力等因素影響（表1）。由遞送系統(tǒng)等因素導(dǎo)致的體內(nèi)效力低下一直是禽類(lèi)DNA疫苗開(kāi)發(fā)應(yīng)用的挑戰(zhàn)。因此，本綜述旨在討論禽類(lèi)DNA疫苗遞送系統(tǒng)的發(fā)展。將討論每種遞送系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)。

2. DNA疫苗的遞送途徑

有效的DNA疫苗遞送需要誘導(dǎo)強(qiáng)烈且持久的免疫應(yīng)答，能夠在靶向部位產(chǎn)生高水平且持續(xù)的抗原。DNA疫苗的遞送途徑大致可分為黏膜途徑和全身途徑。根據(jù)表1中的數(shù)據(jù)計(jì)算了禽類(lèi)不同接種途徑的相對(duì)比例，并在圖1B中呈現(xiàn)。禽類(lèi)DNA疫苗最廣泛使用的遞送途徑包括肌內(nèi)注射（55%）、口服（23%）、胚內(nèi)注射（I0%）（11%）、滴眼（ED）（4%）和鼻內(nèi)（IN）（3%）（圖1B）。盡管一些新的遞送方法和途徑正在禽類(lèi)中開(kāi)發(fā)或測(cè)試，但然認(rèn)為傳統(tǒng)的肌內(nèi)注射仍是主要的DNA疫苗遞送途徑。大多數(shù)禽類(lèi)DNA疫苗（約55%）以裸DNA的形式通過(guò)肌內(nèi)注射到禽類(lèi)的腿部、胸部或大腿肌肉中，并取得了一些令人鼓舞的結(jié)果。通過(guò)肌內(nèi)免疫編碼H5基因的DNA疫苗，在鵪鶉中誘導(dǎo)了對(duì)高致病性H5N1 AIV感染的完全保護(hù)。理想情況下，DNA疫苗的遞送不應(yīng)具有侵入性。然而，常用的大多數(shù)腸胃外途徑是基于針頭的遞送，因此可能會(huì)對(duì)接種的雞造成并發(fā)癥。與腸胃外途徑相比，禽類(lèi)的口服接種更快且更容易進(jìn)行大規(guī)模應(yīng)用，不需要訓(xùn)練有素的人員，且沒(méi)有針刺傷或交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)?？诜庖吣軌蛘T導(dǎo)黏膜免疫應(yīng)答，是第二受歡迎的途徑，約占禽類(lèi)接種的23%。

胚內(nèi)接種是禽類(lèi)特有的第三種最常用的接種途徑，約占11%。

有人提出將裸DNA與載體包封，以改善抗原的控釋?zhuān)瑥亩岣逥NA疫苗的效力。無(wú)論活疫苗、減毒疫苗、滅活疫苗還是DNA疫苗，包括鼻內(nèi)和口服在內(nèi)的非侵入性接種都可以減少應(yīng)激、疼痛和接種成本，并提高大型禽類(lèi)群體的接種安全性。

此外，成功的鼻內(nèi)和口服遞送往往能比其他途徑更好地誘導(dǎo)黏膜免疫力，以對(duì)抗禽類(lèi)呼吸道病毒，如傳染性支氣管炎病毒（IBV）、新城疫病毒（NDV）和禽流感病毒（AIV）。因此，載體的設(shè)計(jì)應(yīng)有助于提高鼻內(nèi)或口服遞送的DNA疫苗的效力和穩(wěn)定性。載體必須能夠抵抗降解和免疫系統(tǒng)的攻擊，并具有足夠的安全性，才能成為成功的遞送系統(tǒng)。

3. 遞送載體

無(wú)論選擇哪種途徑，傳統(tǒng)裸DNA疫苗的低效性一直被認(rèn)為是主要障礙之一。為了克服這個(gè)問(wèn)題，有人提出使用具有更高效啟動(dòng)子的改良表達(dá)載體和佐劑來(lái)提高禽類(lèi)DNA疫苗的效力。Lee等人證明，使用帶有巨細(xì)胞病毒（CMV）啟動(dòng)子的pCI-neo HA質(zhì)粒能夠有效增強(qiáng)雞對(duì)流感病毒的抗體應(yīng)答。大多數(shù)成功用于禽類(lèi)DNA疫苗開(kāi)發(fā)的質(zhì)粒與用于哺乳動(dòng)物DNA疫苗的質(zhì)粒基本相同，很少有專(zhuān)門(mén)為禽類(lèi)應(yīng)用開(kāi)發(fā)和使用的質(zhì)粒，如pCAGGS（抗原轉(zhuǎn)錄受雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子控制）。

密碼子優(yōu)化基于選擇在細(xì)胞質(zhì)中具有最高tRNA利用頻率的密碼子三聯(lián)體，這可以提高翻譯速率和mRNA穩(wěn)定性。成功的DNA疫苗接種需要抗原基因在宿主中高效表達(dá)，這種方法通常用于誘導(dǎo)外源蛋白的產(chǎn)生。Kozak序列通過(guò)增加轉(zhuǎn)錄過(guò)程中核糖體識(shí)別AUG起始密碼子的機(jī)會(huì)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的翻譯起始過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

此外，還發(fā)現(xiàn)Kozak序列在免疫后能夠增強(qiáng)DNA疫苗的表達(dá)。然而，在兩項(xiàng)報(bào)告中，帶有Kozak序列的DNA疫苗對(duì)馬立克氏?。∕D）和禽流感病毒的效力并沒(méi)有得到充分支持。研究發(fā)現(xiàn)，富含胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤脫氧核苷酸（CpG）基序的寡脫氧核苷酸能夠增強(qiáng)雞的先天免疫力，并在攻擊后有效保護(hù)（約80%）雞免受鼠傷寒沙門(mén)氏菌敗血癥的影響。除了使用改良的表達(dá)載體和啟動(dòng)子外，多價(jià)DNA疫苗的開(kāi)發(fā)增強(qiáng)了細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。Sawant等人構(gòu)建了一種雙價(jià)DNA疫苗，同時(shí)表達(dá)新城疫病毒的HN和F抗原以及雞免疫調(diào)節(jié)IL-4基因。通過(guò)肌內(nèi)途徑接種的雞表現(xiàn)出新城疫病毒特異性抗體和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力增加。該DNA疫苗對(duì)40%的雞提供了針對(duì)新城疫病毒攻擊的保護(hù)。

研究還發(fā)現(xiàn)，將結(jié)核分枝桿菌HSP70或Esat-6基因與禽流感病毒H5N1的H5基因融合能夠增強(qiáng)雞的抗體應(yīng)答。除了兩個(gè)基因的融合外，Lim等人證明，在兩種不同的質(zhì)粒中共同遞送N1和IL-15比單獨(dú)接種N1在雞中誘導(dǎo)更高的體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力[9]。共表達(dá)雞IL-2和IL-7增強(qiáng)了體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力，并提高了表達(dá)VP2的DNA疫苗對(duì)雞傳染性法氏囊病病毒的保護(hù)效力。此外，據(jù)報(bào)道，帶有二甲基亞砜的DNA佐劑中性脂質(zhì)適用于新城疫病毒和傳染性法氏囊病病毒蛋白的胚內(nèi)接種。在禽類(lèi)醫(yī)學(xué)中，許多單價(jià)DNA疫苗的開(kāi)發(fā)取得了進(jìn)展，盡管理想的實(shí)際農(nóng)場(chǎng)DNA疫苗應(yīng)能對(duì)抗多種物種。構(gòu)建了針對(duì)四種艾美耳球蟲(chóng)的新型多價(jià)T細(xì)胞表位DNA疫苗，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明該疫苗能有效保護(hù)雞免受柔嫩艾美耳球蟲(chóng)、毒害艾美耳球蟲(chóng)、巨型艾美耳球蟲(chóng)和堆型艾美耳球蟲(chóng)這四種球蟲(chóng)的感染。

已表明胚內(nèi)遞送CpG DNA可減少雞的腸炎沙門(mén)氏菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌和大腸桿菌感染。發(fā)現(xiàn)其能介導(dǎo)針對(duì)流感的抗病毒應(yīng)答，這與肺中的巨噬細(xì)胞應(yīng)答相關(guān)。在另一項(xiàng)試驗(yàn)中，胚內(nèi)遞送CpG DNA在孵化后第1天增加了氣管、肺、十二指腸、大腸、脾臟和法氏囊中IgM、KUL01、CD8和CD4 T細(xì)胞的募集。然而，這些修飾只能部分解決DNA疫苗效力低的問(wèn)題，因?yàn)榭乖蔬f細(xì)胞仍然沒(méi)有被特異性靶向，并且編碼的抗原沒(méi)有被遞送到靶部位以產(chǎn)生足夠的黏膜或器官特異性免疫。

除少數(shù)例外情況，裸質(zhì)粒提供的保護(hù)效力低于100%。例如，通過(guò)胚內(nèi)途徑施用攜帶新城疫病毒F和HN基因的裸質(zhì)粒只能為28%的雞提供保護(hù)[42]。據(jù)報(bào)道，其他攜帶針對(duì)禽流感病毒、傳染性喉氣管炎病毒、傳染性支氣管炎病毒、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖癥病毒和鴨腸炎病毒的抗原的裸質(zhì)粒提供的保護(hù)效力范圍為50%至90%。然而，在另一個(gè)例子中，攜帶針對(duì)禽流感病毒的H5抗原的裸質(zhì)粒通過(guò)基因槍?zhuān)℅G）遞送給雞時(shí)，能夠提供100%的保護(hù)（表1）。Park等人證明，通過(guò)胚內(nèi)途徑用編碼VP2、VP3和VP4抗原的DNA疫苗初次免疫，然后通過(guò)肌內(nèi)注射滅活的傳染性法氏囊病疫苗加強(qiáng)免疫，能夠完全保護(hù)雞免受高致病性傳染性法氏囊病病毒的侵害。

 4. 生物載體

細(xì)菌被描述為用于遞送針對(duì)各種疾?。ú《?、細(xì)菌和寄生蟲(chóng)）的DNA疫苗的“微型可編程機(jī)器人工廠”。30多年前，Walter Schaffner首次報(bào)道了從細(xì)菌到哺乳動(dòng)物細(xì)胞的體外基因轉(zhuǎn)移，其中使用大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室菌株將SV40病毒基因組的串聯(lián)拷貝轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中?；诩?xì)菌的DNA遞送系統(tǒng)能夠在宿主中復(fù)制，并且通過(guò)攜帶自身的免疫刺激因子，不僅能引發(fā)針對(duì)質(zhì)粒編碼的外源抗原的免疫應(yīng)答，還能引發(fā)針對(duì)細(xì)菌載體本身的免疫應(yīng)答。簡(jiǎn)而言之，作為禽類(lèi)DNA疫苗載體的細(xì)菌分為革蘭氏陽(yáng)性（非致病性）和革蘭氏陰性菌株（減毒致病菌）。

 4.1 革蘭氏陰性菌作為DNA疫苗的潛在載體

已有一些革蘭氏陰性致病菌，如大腸桿菌和沙門(mén)氏菌，被分離出來(lái)并用于禽類(lèi)DNA疫苗的遞送。細(xì)胞內(nèi)革蘭氏陰性菌的運(yùn)輸可分為吞噬體內(nèi)途徑和胞質(zhì)內(nèi)途徑。關(guān)于細(xì)菌在宿主細(xì)胞中的局部感染，用作DNA疫苗載體的腸道致病菌可分為（1）胞外病原體，如大腸桿菌或耶爾森氏菌屬（假結(jié)核耶爾森氏菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌）；（2）吞噬體內(nèi)細(xì)菌，如沙門(mén)氏菌屬；以及（3）胞質(zhì)內(nèi)細(xì)菌，如志賀氏菌屬和單核細(xì)胞增生李斯特菌（圖2）。用攜帶傳染性法氏囊病病毒VP2基因的轉(zhuǎn)基因大腸桿菌DH5α口服免疫雞，獲得了95.4%的保護(hù)率。

 4.1.1 沙門(mén)氏菌

沙門(mén)氏菌作為一種非宿主特異性的細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌，是禽類(lèi)的共生菌，能夠在胃腸道（GI）中持續(xù)存在。來(lái)自多種宿主的不同沙門(mén)氏菌血清型都能感染禽類(lèi)。因此，禽類(lèi)可以被宿主特異性和非宿主特異性的沙門(mén)氏菌血清型感染。禽類(lèi)全身性沙門(mén)氏菌病的特征包括三個(gè)不同階段：沙門(mén)氏菌通過(guò)胃腸道入侵、在巨噬細(xì)胞中建立感染以及隨后通過(guò)免疫系統(tǒng)清除感染。否則，禽類(lèi)會(huì)發(fā)展為沙門(mén)氏菌病的亞臨床階段并死亡。

沙門(mén)氏菌與禽類(lèi)關(guān)系密切，由于其能夠通過(guò)誘導(dǎo)黏膜和內(nèi)臟器官免疫來(lái)提高疫苗的效力，因此已被評(píng)估為誘導(dǎo)針對(duì)多種感染的保護(hù)性應(yīng)答的活載體。沙門(mén)氏菌能夠入侵、存活并在抗原呈遞細(xì)胞（巨噬細(xì)胞）中增殖，這是沙門(mén)氏菌作為疫苗開(kāi)發(fā)載體的關(guān)鍵特征。此外，減毒活沙門(mén)氏菌能夠通過(guò)未知機(jī)制將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒釋放到真核細(xì)胞質(zhì)中（圖2）。因此，沙門(mén)氏菌是禽類(lèi)DNA疫苗開(kāi)發(fā)中一種很有前景的載體。

圖2  DNA疫苗不同遞送載體將疫苗遞送到宿主細(xì)胞的原理  (1)細(xì)菌遞送 a細(xì)菌帶著重組質(zhì)粒入侵到細(xì)胞，逃離囊泡，細(xì)菌在胞漿內(nèi)死亡并釋放出質(zhì)粒；b沙門(mén)氏菌首先入侵細(xì)胞，在囊泡中死亡，將重組質(zhì)粒釋放到細(xì)胞漿 (2) 多聚陽(yáng)離子通過(guò)將帶負(fù)電荷轉(zhuǎn)變?yōu)閹д姾蓪①|(zhì)粒分子壓縮為更緊湊的構(gòu)像。包被的質(zhì)粒帶大量的正電荷可導(dǎo)致質(zhì)粒分子壓縮，改變緩沖能力，減少對(duì)內(nèi)吞溶酶體試劑的需求，緩沖能力改變導(dǎo)致滲透膨脹、膜裂解和質(zhì)粒釋放。

沙門(mén)氏菌能夠經(jīng)口感染動(dòng)物和人類(lèi)。攝入后，一部分細(xì)菌能夠抵抗胃腸道的低pH值并到達(dá)回腸和盲腸；然后，沙門(mén)氏菌可以通過(guò)在黏膜下層和派爾集合淋巴結(jié)中增殖來(lái)入侵黏膜。在免疫系統(tǒng)未成熟的幼禽中，細(xì)菌在盲腸中大量復(fù)制。

已采用各種減毒方法來(lái)降低鼠傷寒沙門(mén)氏菌的致病性，同時(shí)保留其侵入能力，并能將異源質(zhì)粒遞送到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。鼠傷寒沙門(mén)氏菌SV4089是野生型鼠傷寒沙門(mén)氏菌SL1344的雙突變體（Dam?和PhoP?），是一種減毒沙門(mén)氏菌菌株，已被廣泛用作不同動(dòng)物模型中DNA疫苗的載體。研究表明，鼠傷寒沙門(mén)氏菌SV4089以高達(dá)101?cfu/mL的劑量口服對(duì)雞無(wú)致病性，而野生型SL1344對(duì)雞的口服半數(shù)致死量約為10?cfu/mL。減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌SV4089在轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的安全性以及體外和體內(nèi)穩(wěn)定性方面提供了獨(dú)特的替代方案。DNA疫苗生產(chǎn)成本低、劑量大，且口服接種到宿主后易于檢測(cè)和監(jiān)測(cè)。此外，減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌SV4089能夠入侵并通過(guò)接種雞的各種器官，如肝臟、脾臟和盲腸，而沒(méi)有全身感染的跡象。

減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌已被用作禽類(lèi)中針對(duì)不同病原體的DNA疫苗載體。在一項(xiàng)研究中，用含有pcDNA3/柔嫩艾美耳球蟲(chóng)5401抗原的減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌SV4089口服接種雞，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的體液和細(xì)胞免疫，對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的攻擊提供了部分保護(hù)（55-57.5%）。Li等人證明，用含有傳染性法氏囊病病毒完整多蛋白（VP2/4/3）的減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌SV4089口服接種雞，對(duì)強(qiáng)毒傳染性法氏囊病病毒的攻擊也提供了73.3%的保護(hù)。在另一項(xiàng)研究中，Jazayeri等人表明，用10?cfu/mL的含有編碼H5N1血凝素（HA）基因的真核表達(dá)載體的鼠傷寒沙門(mén)氏菌SV4089對(duì)雞進(jìn)行單次口服免疫，沒(méi)有產(chǎn)生任何臨床癥狀?？诜臃N的雞表現(xiàn)出抗H5抗體產(chǎn)生、CD4/CD8 T細(xì)胞水平增加以及針對(duì)禽流感病毒的混合促炎性/Th1樣細(xì)胞因子應(yīng)答，這對(duì)病毒清除很重要。

除了減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌菌株SV4089外，另一種減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌菌株SL7207也被研究作為DNA疫苗的載體。Pan等人表明，用減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌SL7207攜帶的HA DNA疫苗口服接種白來(lái)航雞，并使用滅活的H9N2疫苗加強(qiáng)免疫，能夠在攻擊后對(duì)H5N1提供100%的保護(hù)，且無(wú)病毒脫落或臨床癥狀。Wan等人使用1.0×101?cfu/mL的鼠傷寒沙門(mén)氏菌SL7207作為載體，通過(guò)σC蛋白對(duì)雞進(jìn)行口服接種以預(yù)防禽呼腸孤病毒（ARV）。結(jié)果顯示產(chǎn)生了高水平的抗體，并且66.7%的雞對(duì)禽呼腸孤病毒攻擊具有保護(hù)作用[66]。除了接種雞外，通過(guò)減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌SL7207載體口服遞送針對(duì)鴨腸炎病毒（DEV）的DNA疫苗，該載體共表達(dá)UL24（核心皰疹病毒基因）和大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞基（LTB）作為黏膜佐劑，能夠誘導(dǎo)有效的全身和黏膜免疫應(yīng)答，并對(duì)雛鴨提供60-80%的保護(hù)。此外，口服遞送攜帶編碼鴨坦布蘇病毒prM和E包膜蛋白的DNA疫苗（pVAX1-SME）的沙門(mén)氏菌SL7207菌株表現(xiàn)出較強(qiáng)的免疫原性，并對(duì)100%的鴨提供了針對(duì)鴨坦布蘇病毒感染的保護(hù)?？诜臃N鴨坦布蘇病毒疫苗提供了一種快速的疫苗遞送策略，且對(duì)于大規(guī)模臨床應(yīng)用具有經(jīng)濟(jì)性。Jiao等人報(bào)道，通過(guò)腸炎沙門(mén)氏菌經(jīng)口服和鼻內(nèi)途徑遞送的編碼S1和N基因的DNA疫苗能夠誘導(dǎo)體液和黏膜免疫應(yīng)答，并對(duì)70%的雞提供了針對(duì)傳染性支氣管炎病毒的保護(hù)。

 4.2 革蘭氏陽(yáng)性乳酸菌

乳酸菌（乳球菌、鏈球菌和乳桿菌）是非芽孢菌，G + C含量低，且為非致病性食品級(jí)細(xì)菌。它們是作為佐劑、免疫刺激劑和活抗原載體在黏膜水平遞送抗原和細(xì)胞因子的優(yōu)良候選者。Dieye等人將乳酸乳球菌表征為蛋白質(zhì)遞送（VP2和VP3）的潛在載體，作為針對(duì)雞傳染性法氏囊病病毒的活黏膜疫苗。

此外，Moeini等人表明，攜帶雞貧血病毒（CAV）VP1蛋白的嗜酸乳桿菌在口服接種的雞中誘導(dǎo)了針對(duì)雞貧血病毒的中和抗體和Th1細(xì)胞因子，并建議乳桿菌也可用作雞口服免疫的潛在載體。在另一項(xiàng)研究中，Wang等人證明，用表達(dá)禽HA1蛋白的重組乳桿菌（LDL17-pH）口服接種雞，能夠顯著增加特異性黏膜抗HA1 IgA水平和抗HA1血清IgG水平。這些雞對(duì)H5N1病毒的致死性攻擊有60%的保護(hù)率。

 5. 物理載體

物理方法是最常用于DNA疫苗遞送的方法。然而，物理載體需要成功滲透靶細(xì)胞的細(xì)胞膜并將DNA疫苗釋放到細(xì)胞質(zhì)中?；诰坳?yáng)離子的遞送系統(tǒng)是一種很有前景的非病毒遞送方法，因?yàn)槠浞肿訉?shí)體可以被修飾以微調(diào)并改變其物理化學(xué)性質(zhì)。由于DNA是一種大分子（長(zhǎng)度可達(dá)1μm），帶負(fù)電荷，而且通?；罴?xì)胞的質(zhì)膜具有相應(yīng)的親脂性且也帶負(fù)電荷，因此預(yù)計(jì)細(xì)胞膜可能會(huì)成為大尺寸多核苷酸的屏障。此外，裸DNA與細(xì)胞膜的結(jié)合性較差。

聚陽(yáng)離子已被用于解決將核苷酸的負(fù)電荷改變?yōu)檎姾刹①|(zhì)粒的分子大小壓縮成緊湊結(jié)構(gòu)的問(wèn)題，這是將核苷酸轉(zhuǎn)染到大多數(shù)類(lèi)型真核細(xì)胞中所必需的（圖2）。帶有輕微正電荷的包封DNA可能會(huì)與細(xì)胞膜發(fā)生靜電相互作用，然后被內(nèi)化。在靜電相互作用期間，DNA在陽(yáng)性聚合物表面的吸附在提高DNA疫苗的效率方面起著重要作用。更重要的是，納米級(jí)的陽(yáng)離子聚合物受到了更多關(guān)注，因?yàn)樗鼈冞M(jìn)一步增強(qiáng)了DNA疫苗的化學(xué)穩(wěn)定性，并誘導(dǎo)了更強(qiáng)的免疫應(yīng)答，因?yàn)閿y帶DNA疫苗的納米顆粒載體被免疫細(xì)胞（如樹(shù)突狀細(xì)胞（DC））的攝取效率很高。

陽(yáng)離子納米聚合物之一是納米聚乙烯亞胺（PEI），它能夠與質(zhì)粒DNA（pDNA）發(fā)生靜電結(jié)合，并將其濃縮成帶正電荷的分子，比裸DNA更有效地被細(xì)胞攝取。在聚乙烯亞胺類(lèi)型中，發(fā)現(xiàn)支鏈聚乙烯亞胺在遞送ompA基因以保護(hù)免受鸚鵡熱衣原體感染方面比線性聚乙烯亞胺更有效和穩(wěn)定。支鏈聚乙烯亞胺能夠在接種后激活體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。這一效果可能是由于聚乙烯亞胺遞送DNA激活了抗原呈遞細(xì)胞，如樹(shù)突狀細(xì)胞[76]。然而，這種接種只能幫助減少鸚鵡熱衣原體的脫落并縮短感染雞的臨床癥狀持續(xù)時(shí)間，但未能對(duì)攻擊產(chǎn)生足夠的保護(hù)。除了聚乙烯亞胺外，發(fā)現(xiàn)聚（丙交酯-共-乙交酯）（PLGA）也是有效的，因?yàn)樗梢匝娱L(zhǎng)并促進(jìn)DNA的可持續(xù)釋放，而DNA會(huì)被抗原呈遞細(xì)胞攝取。發(fā)現(xiàn)聚乙烯亞胺和聚（丙交酯-共-乙交酯）在遞送傳染性法氏囊病病毒的VP2基因方面均有效，并引發(fā)了體液（IgG）和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫（CD4/CD8）。Negash等人使用吸附有攜帶VP2基因的重組質(zhì)粒的聚（丙交酯-共-乙交酯）-聚乙烯亞胺微粒，表明對(duì)雞的免疫可以提高傳染性法氏囊病病毒DNA疫苗的效力，預(yù)防多達(dá)80%的禽類(lèi)發(fā)病和死亡。

其他生物材料，如殼聚糖，也已被用作禽類(lèi)DNA疫苗的載體。以白來(lái)航雞為模型，用攜帶空腸彎曲桿菌FlaA基因的殼聚糖/DNA納米顆粒進(jìn)行鼻內(nèi)免疫。它們產(chǎn)生了顯著增加水平的抗空腸彎曲桿菌IgG抗體和腸黏膜抗體（IgA）。同時(shí)，Zhang等人成功制備了球形殼聚糖納米顆粒，平均直徑在100至200nm之間，表面帶正電荷，能夠保護(hù)DNA免受DNase I降解。用殼聚糖納米顆粒包封的含有HN和雞IL-2基因的質(zhì)粒DNA顯示出提高的DNA疫苗效力，并引發(fā)了針對(duì)雞新城疫病毒攻擊的血凝抑制（HI）抗體滴度和IFN-γ[80]。最近，Gong等人還成功開(kāi)發(fā)了殼聚糖納米顆粒（球形，約200nm）來(lái)包封針對(duì)多殺性巴氏桿菌的ptfA-DNA疫苗，包封效率為95.3%，且該制劑能有效抵抗DNase降解。將包封的ptfA-DNA疫苗肌內(nèi)接種到4周齡雞中，誘導(dǎo)的抗體濃度和淋巴細(xì)胞增殖高于裸DNA，并提供了68%的保護(hù)率，而裸DNA為56%。用殼聚糖納米顆粒包封的編碼新城疫病毒F抗原的DNA疫苗進(jìn)行鼻內(nèi)和肌內(nèi)免疫，分別誘導(dǎo)了100%和80%的雞保護(hù)率。

除了更高的溶解度和對(duì)細(xì)胞的滲透性外，納米顆粒還提供了與其他納米材料綴合的靈活性，以進(jìn)一步提高遞送的特異性和效力。此外，Jazayeri等人制備了帶有聚乙二醇的綠色銀納米顆粒（nanoAg），用于將禽流感病毒H5基因遞送到雞十二指腸原代細(xì)胞中。結(jié)果表明，納米銀能夠完全包封DNA，保護(hù)H5基因免受DNase I的影響，并在轉(zhuǎn)染后1小時(shí)內(nèi)將復(fù)合物轉(zhuǎn)移到原代細(xì)胞中。此外，在雞中單次口服施用納米銀包封的DNA/H5質(zhì)粒誘導(dǎo)了抗體和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答以及增強(qiáng)的細(xì)胞因子產(chǎn)生。

物理載體的生物降解性、增強(qiáng)的免疫原性、與其他分子（包括抗體以指定靶標(biāo)遞送）綴合的靈活性以及不涉及活生物體（病毒或細(xì)菌），支持了它們?cè)贒NA疫苗遞送方面取代生物載體的潛力。然而，它們的細(xì)胞毒性、安全性（誘導(dǎo)非特異性炎癥/過(guò)敏反應(yīng)）和DNA負(fù)載能力不僅需要在體外，還需要在獸用疫苗遞送研究的田間試驗(yàn)中進(jìn)一步評(píng)估。目前，禽類(lèi)接種中最常用的口服DNA疫苗遞送載體包括沙門(mén)氏菌屬（70%）、乳酸菌（20%）和納米顆粒（10%）（圖1C）。

6. 結(jié)論

DNA疫苗為禽類(lèi)疫苗的開(kāi)發(fā)提供了一種新的有價(jià)值的方法，并在設(shè)計(jì)靈活性、速度、生產(chǎn)簡(jiǎn)單性以及引發(fā)細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答的能力方面具有優(yōu)勢(shì)。自1993年以來(lái)，禽類(lèi)流感DNA疫苗一直在開(kāi)發(fā)中，最近美國(guó)農(nóng)業(yè)部有條件地批準(zhǔn)了首個(gè)針對(duì)H5N1的雞用DNA疫苗。DNA疫苗可用于儲(chǔ)備，以控制未來(lái)的H5N1流感爆發(fā)。大流行性禽流感病毒株發(fā)生了抗原轉(zhuǎn)變或漂移，使其能夠逃避禽類(lèi)流感疫苗引發(fā)的免疫力。最近的禽流感病毒疫苗開(kāi)發(fā)研究表明，需要針對(duì)高致病性禽流感病毒進(jìn)行額外的系統(tǒng)性疫苗攻擊研究。此外，已證明對(duì)禽類(lèi)疾病具有完全保護(hù)作用，如鴨坦布蘇病毒、傳染性法氏囊病和新城疫。DNA疫苗也存在一些缺陷，如體內(nèi)效力和穩(wěn)定性仍然存在問(wèn)題。此外，在禽類(lèi)中單次DNA疫苗接種通常不足以誘導(dǎo)強(qiáng)大的體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫以及提供完全保護(hù)。因此，通常需要加強(qiáng)免疫。生物載體和物理載體，連同其適當(dāng)?shù)目乖妥魟?，有可能克服DNA疫苗的缺點(diǎn)。盡管攜帶不同抗原的DNA疫苗已通過(guò)不同類(lèi)型的載體和佐劑遞送，但很少有通過(guò)病原體攻擊進(jìn)行評(píng)估的。因此，應(yīng)進(jìn)行額外的體內(nèi)田間試驗(yàn)，以確定當(dāng)前可用的載體、抗原和佐劑對(duì)抗獸用病原體傳染病的效率和安全性。

縮略語(yǔ)

乳酸菌（LAB）；肌內(nèi)（IM）；美國(guó)農(nóng)業(yè)部（USDA）；禽流感病毒（AIV）；抗原呈遞細(xì)胞（APCs）；鴨坦布蘇病毒（DTMUV）；傳染性法氏囊病病毒（IBDV）；新城疫病毒（NDV）；胚內(nèi)（IO）；滴眼（ED）；鼻內(nèi)（IN）；巨細(xì)胞病毒（CMV）；傳染性支氣管炎病毒（IBV）；胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤脫氧核苷酸（CpG）；胃腸道（GI）；血凝素（HA）；禽呼腸孤病毒（ARV）；鴨腸炎病毒（DEV）；雞貧血病毒（CAV）；樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）；聚乙烯亞胺（PEI）；質(zhì)粒DNA（pDNA）；聚（丙交酯-共-乙交酯）（PLGA）；血凝抑制（HI）；納米銀（nanoAg）；聚（2-羥乙基甲基丙烯酸酯）（pHEMA）；基因槍?zhuān)℅G）；參考文獻(xiàn)（Ref）；傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）；糖蛋白（g）；網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖癥病毒（REV）；火雞冠狀病毒（TCoV）；鴨瘟病毒（DPV）；禽病毒性關(guān)節(jié)炎（AVA）；派爾集合淋巴結(jié)（PPs）；盲腸扁桃體（CTs）；病毒中和（VN）；刺突蛋白（S1）；核衣殼蛋白（N）；膜蛋白（M）；靜脈內(nèi)（IV）；腹腔內(nèi)（IP）；皮下（SC）；抗體（Ab）；天（d）；周（wk）。

表1  通過(guò)不同遞送接種禽類(lèi)DNA疫苗的效果

S1針突蛋白 N 核衣殼蛋白 M 膜蛋白 Ab抗體 g 糖蛋白、pHEMA 聚甲基丙烯酸羥乙酯 CTs 盲腸集合淋巴樣組織